一系列微生物聚集成一个大的群落，分泌蛋白质和其他分子物种，形成一个生物膜，使它们能够维持一个受控的环境，供其生长和增殖。除了细菌本身，生物膜还包括一种胞外聚合物质(EPS)，它形成了生物膜的结构支架，生物膜还有多糖、核酸、蛋白质和脂类等组成。功能性细菌淀粉(FuBAs)形式的聚集蛋白是EPS的关键组成部分，为生物膜提供结构稳定性如图1所示，它们共同形成了一个在细胞外空间控制生物膜形成的系统。一般来说，为了使生物膜形成和避免与不受调控的蛋白聚集相关的细胞毒性，淀粉样蛋白需要在周质中保持其可溶性形式，然后出口到细胞外间隙，然后在细胞表面成核和聚集。

  为了达到这一目的，聚集通过转运蛋白、转录因子、伴侣蛋白，甚至特异性辅助成核蛋白来促进单体在细胞表面的靶向聚集。在本文中,作者提出一个体外聚合动力学的分析主要从革兰氏阴性菌大肠杆菌纤毛淀粉样蛋白，FuBA蛋白质,即CsgA FapC,为了研究其异同并检查结果在体内环境中生物膜的形成。CsgA，是从细胞表面分泌的一种非结构蛋白，包含五个具有高度保守的谷氨酰胺和天冬酰胺残基的不完全重复，被认为是淀粉样蛋白形成的重要组成部分。第二个蛋白质研究工作是FapC,它包含三个重复残留区域又包括高度保守的谷氨酰胺和天冬酰胺区域。

  图1 富巴菌与大肠杆菌和荧光菌功能性淀粉样系统的共同成分体内纤维形成机制示意图

  结构和形态

  为了评估体外形成的FapC淀粉样蛋白的性质，在pH 7.0和37℃的溶液中监测重组纯化的FapC的聚集。通过透射电子显微镜(TEM)观察发现，该蛋白自发聚集形成长长的缠绕的原纤维。

  图2 重组表达和纯化的FapC在37℃孵育5天后的100 μM无种子聚集形成的原纤维的TEM图像

  从频谱最低200纳米以下，最低约218纳米可以观察到。这一发现与从基本上随机的线圈结构过渡到聚集后的高片含量结构一致。

  图3 FapC单体和纤维的远紫外CD光谱。在与TEM成像相同的条件下记录光谱

  此外，当淀粉样结合荧光染料硫黄素T (ThT)存在时，单体FapC聚集，随着时间的推移荧光显著增加，这与FapC形成淀粉样纤维一致。同样，在pH 7.4和37℃下，重组的、纯化的CsgA单体可以自发组装成富含β片的纤维结构。

  图4 重组表达和纯化的5 μM 的CsgA在37℃孵育5天后聚集形成的原纤维的TEM图像(图a), CsgA单体和原纤维的远紫外CD光谱(图c)

  动力学分析

  CsgA的聚合是基本完成在10到20 h(2和7之间在单体浓度μM), FapC明显慢的聚合,以20至40 h达到完成，(即使在50到200之间相当高的单体浓度μM)。

  图5a用ThT荧光(彩点)在37°C静置下每15分钟测量单体样品中CsgA的聚集，即在50mm磷酸钾，pH 7.4的无振荡条件下。(b) FapC在37°C静置条件下，每10 min在20mm磷酸钠(pH 7)中聚集一次，单体浓度在50 - 200 μM之间，每种条件重复3次。

  为了确定聚合的机理,为每个蛋白质数据系统安装在全球范围内,单体浓度的同时,通过使用淀粉体界面的动力学方程。采用简单的成核聚合(或成核-伸长)机制，两种蛋白质均获得了高质量的整体匹配。

  图6 原纤维组装成核-伸长机制示意图

  进一步调查通过有核聚合聚合的机理,特别是来验证没有任何显著的自我复制的过程。

  图7(c)在低浓度的预成型种子存在或不存在的情况下，在5 μM的单体浓度和1至100 nM的单体当量的种子浓度下，重复三次进行CsgA的聚合 (d) 100 μM单体FapC在没有预先形成的原纤维种子和存在1、10和100 nM单体等量种子的情况下重复三次聚集。

  当高达1%的总蛋白质量出现,没有对聚合动力学的影响CsgA或FapC观察,确认没有可检测水平的自我复制过程条件下研究,因此支持提出核聚会机制。

  测定的两种蛋白质的伸长速率常数的值是相似的，因为在估计原纤维种子长度的内在不确定性。这一发现表明，两种蛋白在体外聚集率差异的主要原因是明显较低的FapC初成核率。

  图8 CsgA和fac的初成核速率常数和延伸率的比较

  聚集率和生物膜生长的比较

  为了探究这里得到的延伸率值的意义，将其与之前测量的生物膜在体内扩散的速度进行了比较。因为淀粉样蛋白形成的亚过程必须在整个生物被膜形成的时间内完成。研究生物膜的形成体内显示每个矩阵产生主要的边缘细胞生物膜的厚度不变,在一个地区,向外传播的中部地区成熟生物膜。

  图9a生物膜基质的形成发生在位于生物膜边缘的区域。b从1、10和100 μM单体蛋白的伸长速率常数的体外测量中预测淀粉样蛋白的生长速率(蓝条)。绿色区域突出显示了在体内观察到的生物膜扩散速率所需的纤维生长速率

  图a显示了生物膜基质发展的趋势。图b显示了不同单体浓度的体外测量的生长率，并与体内估计的生长率下限进行了比较与生物膜扩散的速度相比，这种低聚集率表明淀粉样蛋白的形成在生物膜形成中的控制机制的潜在作用，以及生物体希望减少聚集倾向。

  文章讨论

  本文对两种功能性淀粉样蛋白的聚集进行了详细的动力学分析，它们来自不相关的细菌，大肠杆菌和荧光细菌。这两种蛋白质的聚集机制仅涉及初级成核和延伸，而引起聚集的自复制的二次过程基本可以忽略。在体内，原纤维不会自我复制，这一现象可能允许只通过细胞表面的成核蛋白来启动新原纤维的生成。通过阻止原纤维在细胞外空间的随机位置进行自我复制，这种机制为细菌细胞提供了调节原纤维数量和位置的可能性，从而控制生物膜的重要特性。综上所述，自然界似乎更青睐具有特定自组装特性的蛋白质作为生物膜淀粉样蛋白成分的构建模块。也就是说，这样的蛋白质应该表现出较低的延伸率(可能提供了一种限制生物膜形成的方法)，并且缺乏自我复制的能力来控制新纤维的形成率和位置。

  参考文献：Andreasen M, Meisl G, Taylor JD, Michaels TCT, Levin A, Otzen DE, Chapman MR, Dobson CM, Matthews SJ, Knowles TPJ. Physical Determinants of Amyloid Assembly in Biofilm Formation. mBio. 2019 Jan 8;10(1):e02279-18. doi: 10.1128/mBio.02279-18. PMID: 30622185; PMCID: PMC6325246.