空肠弯曲杆菌是世界范围内引起人类胃肠炎的主要细菌。空肠弯曲杆菌的抗药性(AMR)通过水平基因转移(HGT)获得或者通过染色体上的自发点突变修改抗生素靶位点而出现。与自发突变相比，大DNA片段的HGT可以引入更多的多态性，并更快地产生新的表型。自然转化是空肠弯曲杆菌中公认的HGT机制，通过这种机制，细菌细胞从环境中摄取游离DNA(即质粒和基因组DNA[gDNA])。生物膜可能是空肠弯曲杆菌在农场到餐桌连续体中的主要生存策略之一，通过其自身生产的聚合物基质嵌入细菌并保护其免受各种压力。与浮游细胞相比，生物膜固着细胞对抗菌剂的抵抗力更强。已知生物膜可促进许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中AMR基因的HGT，细胞外DNA(eDNA)的存在集中在生物膜基质中，这稳定了生物膜结构并为HGT提供了基因库。空肠弯曲杆菌生物膜中eDNA的释放有望为自然转化提供AMR基因的来源。然而，很少有研究研究了空肠弯曲杆菌生物膜中AMR基因的自然转化。

  主要内容：

  1、HGT依赖于细菌生长模式和培养时间

  该团队假设空肠弯曲杆菌F38011等基因AMR菌株之间的HGT也可能在生物膜状态下发生。为了验证这一假设，将等浓度的空肠弯曲杆菌F38011 Kanr和F38011 Cmr分离物混合并接种到聚苯乙烯24孔板中。在最佳生长条件(即37°C，微需氧，Muller-Hinton[MH]肉汤)下静态培养板24至72小时。为了监测HGT的出现，使用1%胰蛋白酶-EDTA溶液从24孔板上酶切去除生物膜固着细胞，随后将其铺在添加有5%脱纤维羊血(MHBA)、氯霉素(20mg/ml)和卡那霉素(50mg/ml)的MH琼脂上。在收获无柄细胞sessile之前，还对24孔板中的上清液进行了计数，反映了新开发的处于浮游状态的AMR突变体与从生物膜释放到环境生态位的AMR突变的混合物。同时，Kanr和Cmr分离物的共培养物在摇动的玻璃管中孵育，以表示浮游状态。

  选择空肠弯曲杆菌F38011作为HGT研究的模型菌株，分别提供对卡那霉素(Kanr)或氯霉素(Cmr)的抗性。假设空肠弯曲杆菌F38011等基因AMR菌株之间的HGT也可能在生物膜状态下发生。结果发现，无论时间如何，在生物膜中观察到的双抗性(Kanr、Cmr)突变体的频率明显高于浮游状态(P，0.05)，增加了6.4至17.5倍。(图1)在24小时的浮游种群中没有发现可检测的HGT突变体。总之，空肠弯曲杆菌F38011的生物膜固着细胞比其浮游细胞更频繁和快速地进行HGT。

  图1 空肠弯曲杆菌F38011 Kanr和Cmr菌株在最佳生长条件下的水平基因转移频率

  2、自然转化在空肠弯曲菌生物膜中的染色体遗传交换中起主要作用

  AMR分离株的进化可能由自发突变和/或HGT引起。在这项研究中，该团队首先研究了自发突变是否导致空肠弯曲杆菌F38011生物膜中存在Kanr-Cmr双抗性突变体。空肠弯曲杆菌F38011 Kanr或Cmr生物膜分别在24孔板中培养72小时。在添加50mg/ml卡那霉素和20mg/ml氯霉素的MHBA上划线后，没有从生物膜细胞中回收双抗性突变体(数据未显示)。这表明在该团队的实验模型中，自发突变是可以忽略的。接下来，该团队进行了DNase I测定，以评估自然转化在获得双抗性谱中的作用。空肠弯曲杆菌通常被视为能够从环境中吸收eDNA并将其整合到染色体中的天然能力。在生物膜生长培养基中添加DNase会降低eDNA的可用性，从而降低自然转化的效率。在这项研究中，该团队在存在0或100U/ml DNase I的情况下，将空肠弯曲杆菌F38011 Kanr和Cmr菌株在24孔板中共培养48小时。

  如图2所示，在DNase I处理的生物膜中，HGT频率显著下降(P，0.001)，而总固着细胞数量没有受到影响。此外，空肠弯曲杆菌F38011的基因组缺乏质粒和原噬菌体，排除了在AMR进化中接合和转导的可能性。总之，在当前实验室环境下，自然转化是空肠弯曲杆菌F38011生物膜中AMR基因传播的驱动力。

  图2 DNase I在48小时处理空肠弯曲杆菌F38011 Kanr +Cmr生物膜

  3、生物膜特性与基因转移率的相关性

  为了了解生物膜和HGT之间的相互关系，该团队描述了72小时内生物膜特性的时间分布，并将其与HGT率关联。目标生物膜特性包括细胞密度、代谢活性、生物膜生物量和eDNA数量(图3)。为了评估生物膜的细胞密度是否与HGT频率相关，该团队通过平板法定量了空肠弯曲杆菌F38011 Kanr/Cmr生物膜中的总细胞数量。图3A显示，生物膜中的总细胞计数在整个培养期间(24至72小时)保持恒定，而HGT频率从24小时增加到48小时(图1)。换句话说，空肠弯曲杆菌生物膜中的细胞密度不能解释HGT效率随时间的变化。空肠弯曲杆菌NCTC 11168在浮游状态下的自然转化是一个能量依赖性过程。为了测试空肠弯曲杆菌生物膜是否存在这种情况，该团队使用2，3，5-三苯基-四唑鎓氯化物(TTC)测定法测定了生物膜固着细胞的代谢活性。TTC是生物学中用于测量细胞代谢活性的最广泛的试剂之一。当细胞具有代谢活性时，它们可以将无色的TTC溶液转化为深红色的甲赞衍生物，该衍生物可以通过比色光谱法轻松定量。在这项研究中，在不同孵育时间段，TTC测定的吸光度值之间没有观察到显著差异(P>0.05)(图3B)。这一结果在相应的时间点没有遵循HGT频率的相同趋势(图1)，表明空肠弯曲杆菌生物膜中代谢活性与HGT之间缺乏相关性。

  为了探讨生物膜生物量(即EPS和细胞的总和)与HGT之间的相关性，该团队对空肠弯曲杆菌F38011 Kanr/Cmr共培养的生物膜进行了结晶紫染色分析。

  该团队发现空肠弯曲杆菌F38011 Kanr/Cmr共培养生物膜中eDNA浓度与HGT频率之间存在负相关，Pearson相关系数为20.669，P值为0.011(图3D和E)。eDNA浓度在24小时的生物膜中，HGT频率比48至72小时高约2倍(图3D)，而48至72 h的HGT频率显著高于24小时(图1)该团队推测，在24-48小时内，生物膜中eDNA的2倍减少是由于空肠弯曲杆菌细胞摄取eDNA，导致双抗突变体的患病率增加。

  图3 水平基因转移(HGT)过程中生物膜的表征

  4、弯曲杆菌HGT发生在物种内和双物种生物膜中

  为了评估种内遗传交换，该团队培养了两种具有不同基因组背景的标记菌株(F38011和NCTC 11168;表1)的生物膜，并使用平板测定法测定HGT频率(图4)。(i)F38011 Kanr和Cmr(FKFC)，(ii)NCTC 11168 Kanr和Cmdr(1K1C)，(iii)F38011-Kanr和NCTC 11168Cmr(TK1C)，以及(iv)NCTC 11068Kanr和F38011-Cmr(1KFC)。不同空肠弯曲杆菌菌株之间的HGT频率不同。具体而言，空肠弯曲杆菌NCTC 11168在孵育48小时和72小时后的HGT水平显著高于F38011(P，0.05)。当F38011和NCTC 1118混合(即FK1C或FC1K)时，其HGT频率在长达48小时的同基因菌株(即FKFC和1K1C)生物膜范围内。有趣的是，与同基因菌株(即FKFC和1K1C)生物膜相比，双菌株FK1C生物膜显著促进了排卵后72小时的HGT(P，0.05)。72小时时，FK1C生物膜的HGT频率分别比F38011和NTCT 11168生物膜高381倍和9倍。

  图4 双菌株空肠菌生物膜中的水平基因转移

  为了研究双物种生物膜是否影响空肠弯曲杆菌的遗传交换，该团队在24孔培养板中培养了具有大肠杆菌K-12或肠炎链球菌3512H的空肠弯曲杆菌F38011 Kanr和Cmr菌株。HGT频率和弯曲杆菌生长曲线如图所示。当遇到不同组成的生物膜种群时，空肠弯曲杆菌F38011具有不同的HGT趋势。大肠杆菌-空肠弯曲菌生物膜促进了AMR基因在大肠杆菌之间的传播。空肠F38011 Kanr和Cmr菌株，导致HGT频率为2.15x10-8在24小时和3.47x10-8在48h(图5A)。大肠杆菌-C中未观察到Kanr-Cmr双抗性转化体。72小时时空肠生物膜(图5A)，这可能是由于在大肠杆菌的存在下诱导活的但不可培养的细胞和/或抑制空肠弯曲菌。当与肠杆菌共培养时，生物膜上清液中的空肠菌在生物膜形成的早期(即24小时)随机进行HGT(图5C)。然而，生物膜固着细胞中的基因转移在72小时内可以忽略不计(图5C)，因为只有有限数量的空肠梭菌细胞具有可培养性(104至106 CFU/ml;图5D)。

  图5 双物种生物膜中空肠弯曲杆菌的水平基因转移(HGT)

  参考文献：Ma L, Konkel ME, Lu X. Antimicrobial Resistance Gene Transfer from Campylobacter jejuni in Mono- and Dual-Species Biofilms. Appl Environ Microbiol. 2021 Jul 13;87(15):e0065921. doi: 10.1128/AEM.00659-21. Epub 2021 Jul 13. PMID: 33990313; PMCID: PMC8276811.