世界畜牧业正以惊人的速度发展，以满足对高价值动物蛋白日益增长的需求。畜产品是营养价值高的优良蛋白质来源，也是人体必需微量营养素的重要来源。然而，不断增长的动物产量是不可持续的，因此替代传统肉类的培养肉生产更快更有效。培养肉是通过从活哺乳动物身上采集骨骼肌细胞经过繁殖和生长产生肌肉组织。而这项技术的一个主要挑战是细胞生长所需的血清，找到廉价的食品安全的血清替代品是至关重要的。食品生产的副产品数量巨大，含有促进生长的潜在因素，是有前途的血清替代成分。本研究的主要目的是探讨食品级副产物是否可以作为骨骼肌细胞培养的促生长剂，以开发一种的无血清培养基。采用酶法或化学法对鸡胴体、鳕鱼骨架、蛋壳膜、蛋清粉和猪肉血浆等副产品进行水解。除冻干猪肉血浆和酵母抽提物外，还对其水解产物进行了粒度排除色谱、元素燃烧分析和水解度的表征(图1)。将其作为商品血清的补充或替代，并进一步评价其对体外培养的肌细胞代谢活性、细胞增殖和细胞毒性的影响(图2)。结果表明，这些材料对骨骼肌细胞没有细胞毒性。富含约2-15个氨基酸的多肽水解产物被证明能促进细胞生长和代谢活性。在所有的测试材料中，猪肉血浆水解物和酵母抽提物是最有前途的(图3、4)。猪肉血浆水解物在无血清条件下培养3天，与在全血清条件下培养的对照细胞相比，代谢活性提高110%，细胞增殖提高48%。且这一反应依赖于材料和所用选择的酶。

  总的来说，副产物、原料和酶的选择对水解过程中蛋白质的降解有影响，富含长度约为2-15个氨基酸的多肽水解物促进了细胞的生长。其中，猪肉浆水解物和酵母抽提物是最有前途的原料，具有取代血清的潜力，可用于无血清培养基中。

  图1 试验材料和水解物的化学特性，包括鸡胴体(K)、鳕鱼骨干(T)、蛋清(EW)、蛋壳膜(ESM)、猪血浆(PBP)和酵母抽提物(YE)。A：元素燃烧分析法分析总氮含量，凯氏定氮法估算总氮含量，换算系数为6.25。B：用TNBS法测定水解度。C：214 nm(UV)的尺寸排阻色谱(SEC)测定不同原料及其水解副产物的分子量分布(MWD)。原料采用冻干、酶(碱性蛋白酶(A)或风味蛋白酶 (F))或NaOH水解。不同组分(F1-4)除了显示游离氨基酸(F4)外，还显示了具有近似氨基酸长度的肽的百分比：>15(F1)、5-15(F2)和2-5(F3)。

  图2 Celltiter-Glo®发光分析法和Cyquant™法分析细胞代谢活性和细胞增殖。分别在正常血清(2%FBS和2%Ultroser G)、还原血清(1%FBS和1%Ultroser G)和无血清(0%FBS和0%Ultroser G)条件下培养48h。结果以均值±SEM表示(n=66个独立细胞实验，一式三份)。*表示与对照组(细胞在正常血清条件下生长)相比有显著差异。*p<0.0001，采用单因素方差分析，采用Dunnett多重比较检验进行单因素方差分析。

  图3 碱性蛋白酶消化的猪肉血浆(A)、酵母膏(B)以及鸡肉和鳕鱼副产品(C)在无血清条件下恢复并促进细胞生长。这些图表显示了不同材料孵育48小时后牛骨骼肌细胞的相对细胞代谢活性(ATP)、增殖(DNA)或细胞毒性(LDH)，与对照细胞相比，即未处理的细胞在正常血清条件下生长(DMEM培养液中含有2%FBS和2%Ultroser G)。细胞接种于96孔板中，在无血清条件下(0%胎牛血清和0%Ultroser G)添加浓度范围为0.0001~10 mg/ml的蛋白水解物、冷冻干燥猪肉血浆或酵母提取物。用Celltiter-Glo®发光分析法、Cyquant™法分析和细胞毒性检测试剂盒测量发光、荧光或吸光度。结果以均值±SEM表示(n=3-4个独立的细胞实验，分三组进行)。

  图4 蛋清副产品(A)和蛋壳膜副产品(B)的副产物水解物在无血清条件下恢复肌肉细胞的代谢活性和增殖。这些图表显示了不同材料孵育48小时后牛骨骼肌细胞的相对细胞代谢活性(ATP)、增殖(DNA)或细胞毒性(LDH)，与对照细胞相比，即未处理的细胞在正常血清条件下生长(DMEM培养液中含有2%FBS和2%Ultroser G)，细胞接种于96孔板中，在无血清条件下(0%胎牛血清和0%Ultroser G)添加浓度范围为0.0001~10 mg/ml的蛋白水解物。用Celltiter-Glo®发光分析法、Cyquant™法分析和细胞毒性检测试剂盒测量发光、荧光或吸光度。结果以均值±SEM表示(n=3-4个独立的细胞实验，分三组进行)。