抗生素耐药性是一个紧迫的问题，估计到2050年将成为死亡的主要原因。抗菌肽(也称为宿主防御肽(HDPs))和HDP衍生的抗菌剂具有强大的抗菌活性，并且由于耐药性的发展，很有可能成为抗生素的替代品。细菌中已经形成了一些耐药机制，对细菌防御HDPs的全面了解将有助于其在临床上的应用。

  主要内容：

  一种被广泛研究的HDP是LL-37。它是唯一的人类组织蛋白酶，对其作用机制知之甚少。LL-37是一种a-螺旋两亲性肽，其螺旋轴以与细菌表面平行的方式与细菌膜相互作用。它可以形成小的环形孔，导致细胞质渗漏，但也为肽的易位提供了机会。LL-37可与肽聚糖层的成分结合并干扰其合成。

  第二种研究得很好的组织蛋白酶是鸡组织蛋白酶CATH-2。研究表明，组织蛋白酶与脂多糖(LPS)相互作用，并非常迅速地定位于细菌膜，在那里，组织酶内化，在较高浓度下，导致膜透化。另一种非常活跃的组织蛋白酶是猪PMAP-36。它具有螺旋折叠，类似于LL-37和CATH-2，但不同于它们的是其共价二聚的能力，这增强了其成孔能力。其作用机制尚不完全清楚。

  HDPs靶向细菌的多个重要部位，这使其难以产生耐药性。然而，有一些细菌已经开发出抵消HDPs抗菌活性的机制。最常见的机制是分泌使HDPs失去活性的分子;由于HDPs是膜活性分子，细菌也被证明可以改变其膜，使HDPs失去活性。这项研究发现OMVs的存在可以增强细菌对HDPs的抵御力，CATH-2和PMAP-36(而不是LL-37)能够诱导OMV释放。向细菌培养物中添加OMV显示出对所有三种肽的保护作用。

  1 CATH-2和PMAP-36(而不是LL-37)刺激革兰氏阴性菌中OMV的释放

  使用考马斯染色的SDS-PAGE分析分离的pOMV(肽诱导的OMV )和hOMV(热诱导OMV )，并与自发OMV(sOMV)进行比较。PMAP-36存在于分离的pOMV中(图1A，黑色箭头)。CATH-2也存在于pOMV部分(图1A，红色箭头)，但LL-37不存在。这表明三种肽之间的作用机制不同。

  图1 分离的OMV的考马斯染色SDS-PAGE

  为了量化基于脂质的OMV释放的差异，使用了荧光FM4-64膜染料(图2上)。

  观察到热处理后所有细菌的OMV释放显著增加，以及用2.5 mM PMAP-36和CATH2处理大肠杆菌和支气管败血杆菌时OMV释放增加。

  然而，对于铜绿假单胞菌，仅用2.5 mM PMAP-36处理导致OMV释放增加，表明CATH-2的作用是细菌特异性的。由于HDPs是膜活性的，并且FM4-64插入膜中可能受到肽存在的影响，因此动态光散射(DLS)也用于估计OMV粒子的数量(图2下)。DLS的总颗粒计数与FM4-64定量结果一致。

  图2 分离OMV的量化

  2 HDP诱导的OMV在形态学上有所不同

  使用DLS测定细菌HDP处理对所得pOMV大小的影响。

  对于三种革兰氏阴性菌，自发和HDP诱导的OMV的直径约为30至40nm(图3a至c)。

  热处理影响了产生的hOMV的大小，但对所有细菌的影响程度不同。对于支气管败血杆菌，测量了60nm的hOMV，而大肠杆菌的hOMVs大小与sOMV相似，然而，观察到对铜绿假单胞菌非常大的影响，其中发现hOMV的平均直径为150nm。

  图3 分离的OMV的形态学特性

  为了评估形态学和完整性，使用电子显微镜(EM)对OMV进行了可视化(图3d)。

  OMV确实非常小，与DLS结果一致(图3d，白色箭头)。它还表明，热处理会影响OMV的外观，存在更大和更暗的OMV(图3d，黑色箭头)。

  肽处理不会影响OMV的大小，但会影响形态学。所有三种HDP诱导的OMV都显示出圆盘状形状(图3d，红色箭头)。

  沿着这些圆盘状OMV的深色斑块表明，OMV在从细菌释放后裂开(图3d，蓝色箭头)。

  3 OMV保护细菌免受HDPs的侵害

  为了研究在肽处理后OMV的释放是否确实是细菌自我保护手段，进行了稀释试验。

  在轨道稀释试验中，在HDPs与细菌孵育期间添加分离的sOMV，导致sOMV对CATH-2、PMAP-36和LL-37杀伤的保护作用(图4a)。这表明，仅仅存在外膜囊泡就可以作为HDPs的诱饵。

  此外，研究了2.5mM CATH-2(2.5C-OMV)诱导的hOMV和OMV的保护作用，因为这些条件显著增加了OMV的释放。这表明，与PMAP36的sOMV相比，hOMV还保护大肠杆菌免受所有三种肽的杀死(图4b)。

  图4 HDPs杀灭大肠杆菌的评估

  总结：

  宿主防御肽(HDPs)是先天免疫系统的一部分，是抵御入侵病原体的第一道防线。它们对多种病原体具有抗菌活性。然而，已知病原体能够适应恶劣环境。因此，研究了细菌对HDPs治疗的反应。先前的观察表明，亚致死浓度的HDPs增加了大肠杆菌中外膜囊泡(OMV)的释放。首先，分析了HDPs CATH-2、PMAP36和LL-37亚致死处理对几种革兰氏阴性菌OMV释放的影响。PMAP-36和CATH-2处理诱导OMV释放，但LL-37处理没有。OMV在形态学特性方面进行了进一步表征。HDP诱导的OMV通常呈盘状。通过测定大肠杆菌在OMV存在下对HDPs的敏感性，研究了细菌OMV释放的有益效果。OMV存在时，最小杀菌浓度增加。因此，OMV释放是细菌处理HDP影响膜的一种手段。此外，OMV充当HDPs的诱饵，从而保护细菌。

  参考文献：

  Balhuizen MD, van Dijk A, Jansen JWA, van de Lest CHA, Veldhuizen EJA, Haagsman HP. Outer Membrane Vesicles Protect Gram-Negative Bacteria against Host Defense Peptides. mSphere. 2021 Aug 25;6(4):e0052321. doi: 10.1128/mSphere.00523-21. Epub 2021 Jul 7. PMID: 34232080; PMCID: PMC8386409.