细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞培养中常见而又重要的工作之一。

为什么要进行细胞冻存呢？只要我们一直培养着细胞不就可以一直使用了吗？其实细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的重要作用。细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦开始原代培养，它的各种生物特性都将并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。因此及时进行细胞冻存十分必要。

当然不是什么时候都能进行细胞冻存，那什么时候冻存细胞才是最好的？就以贴壁细胞来说，一般都是长满单层，显微镜下看到细胞形态良好就可以进行细胞冻存。

那么，制备好细胞悬液就可以直接放冷冻保存了吗？当然是不可以的。一般的培养基血清甚至是细胞本身，都含有大量的水分，水在低于零度的条件下会结冰形成冰晶，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞大量死亡。而未结冰的溶液中电解质浓度升高，如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，复苏时大量水分会进入细胞内，会再次造成细胞死亡。所以，细胞冻存要加入冷冻保护剂，以保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂易与溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过改变未结冰溶液中电解质的浓度降低其渗透压摩尔浓度，使细胞免受溶质损伤。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。

除了添加冷冻保护剂，冷冻速度的快慢也是关键因素，“慢冻快融”这种公认的方法中的慢冻就是指降温的速度不能快，当然也不能太慢，这直接关系到冷冻效果。  当细胞冷冻温度降至-5℃时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰。降至-5到-15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。当降温速率太慢时，胞内冰晶的形成风险较低，同时说明细胞脱水最大化;当降温速度较快，胞内脱水，胞内溶质的含量和细胞收缩都不太严重，且细胞暴露在非生理环境的时间更短;当降温速率太快，没有充分脱水，就不能阻止胞内冰核的形成。

太快和太慢都能很好的保存细胞存活率，需要着重于稳定速率降温。我们可以需要根据冻存条件而选择不同的冻存方式和设备。 标准的冻存程序为降温速率每分钟下降1~3 ℃。当温度达-25 ℃以下时，可增加至每分钟下降5~10 ℃;到-80 ℃时，则可迅速浸入液氮中。液态氮的低温环境(-196℃)是目前效率来说最好的冷冻保存温度。在-196℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能却完好。如果冷冻过程得当，一般的细胞样品在-196℃下可保存十年以上。-80℃保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。细胞冷冻储存在-80℃冰箱中一般可以保存一年。

复苏细胞应采用快速融化的方法，操作是从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。