噬菌体核酸和蛋白质检测方法

2024-04-23 10:47:31
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核心提示:随着该领域的进步,开发了定量PCR(qPCR)。类似地,蛋白质检测领域也迅速发展,液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)可用于精确检测和计数未知样品中的多肽。

  聚合酶链式反应(PCR)是一种简单而可靠的方法,它以核酸检测为基础,能比噬菌斑测定更快地验证噬菌体的存在。通过应用随机扩增多态性DNA (RAPD) PCR还可以在几小时内区分出不同的噬菌体谱系,而不需要进行全基因组测序。然而,由于噬菌体中没有普遍存在的标志性基因(如细菌中的16S rRNA基因),因此设计针对整个噬菌体多样性的引物很麻烦。PCR的另一个缺点是结果不可量化,因为该反应具有终点特征。随着该领域的进步,开发了定量PCR(qPCR)。类似地,蛋白质检测领域也迅速发展,液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)可用于精确检测和计数未知样品中的多肽。

  嵌入荧光染料的发现使人们能够测量每个PCR循环后聚合的DNA产物的量,即定量聚合酶链式反应(qPCR)方法。荧光由热循环仪记录,能够一步扩增核酸并检测荧光。计算初始DNA浓度时,可以将标准用作参考。整个qPCR平台中使用了两种基本化学成分:第一种是嵌入荧光DNA染料,第二种是通过探针、附加的带有荧光染料和猝灭剂分子的短DNA片段进行操作。对于双链DNA的定量,嵌入染料的使用选择性比较低,使用荧光标记的探针更精确,因为只有在所有三个DNA片段(正向引物,反向引物和探针)成功杂交并随后聚合后才能产生信号,这两种方法已广泛用于噬菌体生物学。

  在液滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)中,将样品与疏水性物质混合形成水油乳状液,反应在每个液滴中同时进行。将混合物通过荧光检测器来计数在总液滴数量上发生放大的液滴数量。这与样品中模板DNA的数量成比例,因此无需外部标准就可以用于计算初始浓度。

  全基因组测序(WGS)不需要预先分离,即可通过生物信息学分析对完整的噬菌体基因组进行测序和组装。Illumina测序技术通常用于识别新的噬菌体,还可以检测来自不同栖息地的病毒,但是它们并没有针对计数进行优化。一些关于丰度的信息可能会被从组装的重叠群的数量中提取出来,从而提供半定量数据。但是在重叠群组装过程中数据的丢失,可能会导致样本中噬菌体的数量被低估。此外,细菌宿主DNA的携带、缺乏参考噬菌体基因组的数据库以及噬菌体基因组的镶嵌性质使得病毒全基因组测序作为一种计数和检测方法具有一定的挑战性,除非事先知道序列。

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