由Kary Mullis建立的PCR技术在今天已成为了DNA分析最常用的技术，在DNA重组与表达、基因结构分析等领域也得到了广泛应用。此技术利用具有靶标特异性的引物实现特定DNA的扩增，可以在几小时内获得大量单一核酸片段，在分子生物学研究中具有举足轻重的意义。在PCR实验中，最佳的引物序列及恰当的浓度是获得高反应特异性和最大扩增效率的关键。所使用的引物特异性不足或者易于形成二聚体，都会导致扩增产物减少甚至没有产物。鉴于PCR引物的重要性，本文就以PCR引物设计作出以下建议：

  1)模板保守：引物应根据核酸序列保守区设计并具有高特异性。模板特异性可利用NCBI的Blast功能实现，参考网址：Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query (nih.gov)

  2)引物长度：反应特异性和退火温度及时间部分依赖于引物的长度。理论上，长度在18-30个核苷酸的引物是最好的，不过实际操作中通常选择范围在18-24 bp的引物。引物的长度过长会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶工作，而且会增加二级结构(发夹结构)的出现概率;过短(低于18 bp)会增加在载体或者插入片段上的二级杂交位点，降低反应特异性。另外，还应避免上下游引物长度差超过4，也要避免使用单一碱基的引物，尤其是连续4个(或更多)“G”或“C”的引物。

  3)熔解温度(Tm)：引物的Tm值应处于55-65℃范围内，高于65℃可能会引起二次退火。上下游引物Tm值应彼此靠近，Tm值相差最大不超过3℃，差值增大，反应效率会降低，甚至直接导致反应失败。因为Tm值高的引物在低于退火温度的条件下会发生错配，而Tm值低的引物在高于退火温度的条件下只有很少一部分会与模板结合。

  4)GC含量：GC%是DNA的一个重要特征，并提供了有关退火强度的信息。GC含量，熔解温度和退火温度是严格依赖的。一般情况下，引物的GC含量应该在45%到60%之间。如若Tm值不满足要求，可适当延长引物长度以提高GC含量和Tm值。对于一些GC含量偏高或者偏低的模板，设计引物时GC含量可能不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。

  5)3’端序列：PCR引物的3’端对控制引物错配(False Priming)至关重要。3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A，尽可能使用“G”或“C”。

  6)避免引物二聚体(Dimer)和发夹结构(Hairpin)：设计的引物应避免形成引物二聚体，这既要避免引物分子退火到本身(Self-dimmers)，又要避免引物退火到用于PCR反应的其它引物(Cross-dimmers);与此同时，引物本身还需避免存在互补序列形成发夹结构。发夹结构存在会导致PCR启动无效，降低整体信号。不过，如若发夹结构仅在50℃下存在，则该发夹结构对PCR反应影响可以忽略。对此，常用的引物设计软件(如oligo7)已有相应的评价选项，通常这两项的ΔG绝对值都低于4.5为佳。

  7)自由能：在设计引物时应该考虑“5高3低”原则，也就是5’端的自由能绝对值要比3’端的自由能绝对值高。引物3'端的ΔG绝对值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

  8)其他建议：PCR反应体系中，引物浓度应处在0.1-0.5 μM范围内。

  参考文献doi：10.5897/AJB2003.000-1019