摘要

  普雷沃氏菌是人类肠道内的优势细菌属。多种普氏菌共存于某些个体中，尤其是那些以植物为食的个体。此外，普氏菌属在各种复杂碳水化合物的利用方面表现出可变性。为了研究普氏菌竞争与饮食之间的关系，我们从小鼠肠道中分离了普氏菌属物种，分析了它们的基因组和体内转录组，并在小鼠体内进行了物种之间的竞争实验。不同的优势普雷沃氏菌物种在体内竞争类似的代谢生态位，这与特定多糖利用位点(PUL)的上调有关。普雷沃氏菌繁殖需要复杂的植物衍生多糖，其中阿拉伯木聚糖对物种丰度有显着影响。最大的优势Prevotella菌株编码一种特定的串联重复序列 trsusC/D PUL，促进阿拉伯木聚糖的利用，且在人类普氏菌属菌株中是保守的，特别是在那些食用纯素饮食的菌株中。这些发现表明有效的(阿拉伯)木聚糖利用是促成普氏菌优势的一个因素。

  结果

  1. 不同的普雷沃氏菌菌株控制小鼠肠道微生物组

  1.1 小鼠肠道微生物群组成受到原始养殖设施的强烈影响(ADONIS, R2= 0.41, p值< 1e-04)，而屏障的影响较小(图S1A)。

  1.2 普雷沃菌属是肠道生态系统的天然共生菌，类似于人类和其他动物的微生物群(图 1D)

  1.3 培养工作最初产生了代表五个普雷沃氏菌群的七种不同细菌菌株(图 1D 和S1C;表 S1)。不幸的是，两个物种的分离物在冷冻保存后未能恢复。其他三个先前未描述的物种Prevotella sp. nov. strain PROD (referred to as Prevotella rodentium, DSM103721:OTU_1, cluster 5), Prevotella sp. nov. strain PINT (referred to as Prevotella intestinalis, DSM103738; OTU_16, cluster 1), and Prevotella sp. nov. strain PMUR (referred to as Prevotella muris, DSM103722, OTU_12, cluster 3)可以在冷冻保存后回收并存放在公共储存库中。

  1.4 总之，这些数据揭示了小鼠肠道中普雷沃氏菌属的一种未被充分认识的多样性，确定了5个不同的簇，其中3个具有代表性的分离株现已公开可用于体内功能研究。

  2. 竞争主导了普雷沃氏菌之间的相互作用。

  2.1 不同的普雷沃氏菌菌株相互竞争代谢生态位，但科水平的分类学分析揭示了共同居住后群落的其他变化，例如，乳杆菌科、穆里巴科和螺杆菌科的流行率增加(图 2D)。

  2.2 本实验中来自 CONV_N6 小鼠的P. intestinalis的优势与分类组成和多样性的变化有关，并且它可能不是由普雷沃氏菌之间的直接竞争引起的。

  2.3 每个普雷沃氏物种都能够单独有效地定植该小鼠系。

  2.4 P. intestinalis DSM103738 在竞争中胜过其他两个物种(43.0%，SEM ± 2.4% 对比 4.3% 对比 0.5%，第 14 天)(图 2G)。

  2.5 总之，这些结果表明普氏菌属物种在小鼠肠道中强烈竞争，这基因组多样性并未反映在某些拟杆菌属物种中观察到的互补代谢功能(Rakoff-Nahoum 等，2016)。

  3. 不同糖苷水解酶(GHs)和多糖利用位点(PULs)的存在与P. intestinalis的高适应性相关。

  3.1 与其他两个集群相比，P.canceris/cluster 1、P.rodentium/cluster 5和P. muris/cluster3(162 CAZymes)编码的特征数量更多(图 3A)。

  3.2 P. intestinalis DSM103738 包含一组7种GH，而这些GHs在P.rodentium DSM103721 和P. muris DSM1037212中不存在(图 3B)。使用PULpy(Stewart 等人，2018 年)基于susC/susD样对预测PUL，确定了P. intestinalis/cluster 1 and cluster 2 中PUL的数量最多，而P. rodentium/cluster 5, P. muris/cluster 3, and cluster 4的PUL数量较少。

  3.3 主成分分析(PCA)揭示了体外和体内条件之间每个菌株的不同转录景观(图 3C-3E)。

  3.4 不同的微生物相互作用对普雷沃氏菌物种转录谱有不同的影响(图S3;表S5)。

  3.5 在所有普氏菌属中鉴定了一组通常在体内过表达的基因，这些基因参与复杂多糖的降解和固氮(图 3F-3H，右上象限，表 S5)。

  3.6 P. intestinalis中5个susC基因在体内均高上调，而P. rodentium 和P. muris只有一个susC基因在体内高上调(图3F-3H)。体内表达最多的PUL的鉴定表明，P. intestinalis在体内利用四种主要的PUL(PUL8、PUL10、PUL11和PUL12)，在P.rodentium和P. muris中明显不存在(图 4A-4C 和 S2;表 S5)。

  3.7 虽然P. muris andP. rodentium编码了相关的GHs和PULs，但从2到5簇的菌株和包括P. muris和P. rodentium的MAGs基因组中没有一个包含任何trsusC/D元素(图S2C)。结合CAZyme预测和PULs重建的基因组分析以及转录组分析表明，P. intestinalis编码并表达了不同的木聚糖和果胶降解基因簇，这可能为P. intestinalis在特定的复合碳水化合物中提供了比其他细菌的竞争优势，包括与其他普氏菌的竞争。

  4.富含阿拉伯木聚糖的饮食调节小鼠肠道中优势普雷沃氏菌的丰度。

  4.1 Prevotella定植SPF_hzi小鼠后，对照组(喂食Stand-PP)在实验过程中保持稳定，而其他组在微生物群中表现出一致的饮食诱导变化(图 5B;第1天至第7天)。

  4.2 在用P. intestinalis和P.rodentium定植后，观察到Rikenellaceae和Lachnospiraceae减少(图 5C，第 14 天与第 1 天)。

  4.3 将小鼠转换为半合成饮食(第1天与第1天)使Synth-HF 中普氏菌科的丰度降低了 12.6 倍和 Synth-LF 中的 3.4 倍，而瘤胃球菌科和卟啉单胞菌科的相对丰度增加(图 5C)。

  4.4 对Prevotella物种的相对丰度的详细分析表明，如先前所观察到的，P. intestinalis 比 P. rodentium的初始优势要好(图 5D)。饮食干预显着降低了P. intestinalis和P. rodentium (Figure 5D).

  4.5 值得注意的是，在饮食转换后的1天内，让小鼠恢复Stand-PP饮食会迅速增加两种普氏菌的相对丰度(图 5D)。

  4.6 在不同的微生物群环境中，普氏菌属在复杂的植物来源多糖存在的情况下在肠道中占主导地位，但在西化饮食中迅速被淘汰。

  4.7 WAX 能够在体外持续促进肠道小肠菌的生长，而纤维素、淀粉或鼠李糖半乳糖醛酸不支持生长(图 S4H 和 S4I)。值得注意的是，果胶在测试的时间点支持体外生长，但不支持体内生长。 总之，这些实验表明，即使在西化饮食中，膳食WAX的利用(可能通过trsusC/D元素)也导致P. intestinalis的扩增。

  5.人类肠道微生物组优势菌株Prevotella copri有广泛的(阿拉伯)木聚糖 PULs。

  5.1 P. copri MAG 聚集在进化枝A(MAG609)、进化枝B(MAG613)和进化枝C(MAG610、MAG611 和 MAG612)内。对这些MAG的相对丰度的分析确定了一个单一的MAG，即MAG609，在样本中非常丰富且普遍存在，尤其是在纯素食者和素食者中(图 6A)。

  5.2 在MAG 中专门搜索了trsusC/D 元素，确定了5个不同的trsusC/D元素，MAG609 和 MAG611 中各有两个，MAG610 中各有一个(图 6B;表 S6)。

  5.3 只有MAG609和P. intestinalis共享PUL-XylL的两个susC/D对的同源物，而其他MAG和Prevotella species分别仅部分共享这些元素或根本不共享这些元素(图 6C 和 6D)。

  5.4 在所有三种饮食中，trsusC/D(+) MAGs的相对丰度都高于不含trsusC/D(-)的MAGs，但在食用纯素饮食的个体中最为显著，与食用植物性食物的小鼠相当(图6E)。

  5.5 trsusC/D(+) MAG609在纯素饮食中的扩增，在素食饮食中也有较低程度的扩增(U-test；p值& lt；0.01和p值< (图6F)。此外，我们观察到素食者中 trsusC/D(+) MAG611的相对丰度最高，而不太普遍的trsusC/D(+) MAG610和trsusC/D(-) MAG612和MAG613没有显示出差异，具体取决于饮食。总之，一个普遍的P. copri菌株编码trsusC/D(+) PUL，与B. ovatus中木聚糖/阿拉伯木聚糖降解PUL高度相似，与P. testinalis共享，而不是其他普氏菌共享，在人类肠道中显示出依赖于饮食的丰度增加。

  图解

  图1：小鼠肠道微生物组中未被鉴定的普雷沃氏菌种

  (A) 研究小鼠饲养设施概况。方框分别表示实验室小鼠或商业小鼠；内部形状表示筛选屏障的数量(n=每个饲养员2-3个卫生屏障；每个屏障9-44只小鼠)。

  (B) 不同普氏菌OTUs在小鼠系中的优势。x轴为Prevotella OTUs (USEARCH_v8.1，>97%相似度)，y轴为相对丰度(%)

  (C) 对所有252只重建小鼠普雷沃氏菌MAGs进行质量评估(iMGMC, Lesker et al.， 2020)。黑点代表实验室小鼠组装的MAGs，红点代表野生小鼠样本重建的MAGs。

  (D) 基于基因组的鼠普雷沃菌分离株系统发育树与小鼠肠道普雷沃菌属的259个元基因组组装基因组(MAGs)和普雷沃菌属的参考基因组聚类(Lesker et al.， 2020)。黑色的分支代表与实验室小鼠相关的MAGs(黑点)。从野生小鼠样本中重建的MAGs用红点突出显示。星星代表七个分离菌株中的每一个。外类群为Paraprevotella xylaniphila和Paraprevotella clara (分支为虚线)。

  图2：在小鼠肠道中，Prevotella intestinalis胜过其他普氏菌。

  (A-E)：共养小鼠品系和使用 16S rRNA 基因测序对其微生物群组成进行纵向分析。

  (A) 普雷沃菌种群竞争实验设计方案。

  (B) 共住前(第1天)和共住期间(第7天和第21天)微生物群组成的NMDS排序分析(Bray-Curtis距离)。颜色表示小鼠品系，形状表示时间点。

  (C) P. intestinalis, P. rodentium, and P. muris 的相对丰度。条形图表示在同居前(第1天?)和同居期间(第7天和第21天)每个小鼠群体的平均值。误差条显示 ± SEM，n = 每个饲养员3–4 只动物。各时间点测定P. intestinalis相对丰度的差异*p<0.05 (Kruskal-Wallis检验)。

  (D) 共居前后15个最丰富科在个体样本中的分类条形图。底部的标签表示老鼠的定殖菌株，彩色的点表示笼子(n =每个笼子5只老鼠;笼子n = 4)。

  (E) 利用观测物种丰富度和Shannon指数进行多样性量化。平均值±SEM(垂直阴影)表示，n =每个处理3-4只动物。*p < 0.05 (Kruskal-Wallis检验)。

  图3 Prevotella ssp中碳水化合物活性酶 (CAZymes)的多样性和淀粉利用系统(sus)的体内表达

  (A) 每个小鼠普雷沃菌群中碳水化合物活性酶 (CAZymes)和多糖利用位点(PULs)的全基因组预测(MAGs n = 151, isolated n = 7)。*p < 0.05 (Mann-Whitney U检验)。

  (B) P. intestinalis DSM103738、P. rodentium DSM103721 和P. muris DSM103722中GHs 家族的存在与否。列出了编码GHs家族的差异。

  (C-H)使用RNA-seq表征Prevotella菌属转录组。

  (C-E) P. intestinalis (C), P. rodentium (D), and P. muris (E).中基因表达的实验设计和主成分分析(PCA 图)(归一化 RNA-seq 计数，参见 STAR 方法)。将分离物定植于SPF_hzi小鼠(“SPF_hzi”)或将指定的复杂微生物组(即分离物的起源)转移到GF小鼠(“complex”)后，比较分离物之间(“体外”)和体内(“体外”)的转录组。数据代表了4个生物重复。

  (F-H) Prevotella spp 中的差异基因表达(复杂微生物组和 SPF_hzi 之间的 log2 倍数变化)，其中 x 轴的倍数变化 (FC) 对应于“复杂微生物组”和“体外”之间的差异; 而 y 轴分别对应于“SPF_hzi”和“体外”。通常在“复杂微生物组”和“SPF_hzi”中上调的基因以蓝色表示，在其中一种体内条件下具有差异表达(FC > 2，p adj < 0.01)的基因是 以红色突出显示。标记的基因表示具有已知功能的基因。 差异表达的susC基因以绿色突出显示。P. intestinalis (F), P. rodentium (G), and P. muris (H).

  图4普雷沃氏菌多糖利用位点(PUL)的体内表达。

  (A-C)普雷沃氏菌中 PUL 的转录组分析。(A) P. intestinalis 有16个，(B) P. rodentium 有9个，(C) P. muris 有6个。热图表示每个普氏菌转录组的标准化读计数(按行缩放)。每个热图上的右列表示每个特征的编码链、淀粉利用系统(紫色的 susC 和橙色的 susD)基因的位置，以及基于相邻 CAZymes 的营养行会。数据代表了4个生物重复。

  图5 不同的多糖和微生物群落对P. Intestinalis定值优势的影响

  (A-D)饮食干预定值了P. intestinalis and P. rodentium.的SPF_hzi 小鼠

  (A) 纵向饮食干预的实验设计，比较标准食物(stand-pp)、富含高脂肪的半合成饮食(60%)(Synth-HF)和低脂肪富含单糖的控制饮食(Synth-LF)(见STAR方法;N = 4只/组)。

  (B) PCoA排序分析肠道微生物群落相似性的变化。每一个形状代表来自指定饮食组的老鼠的粪便样本;y轴表示PCoA1使用Bray-Curtis距离，x轴表示切换饮食的时间点。

  (C) 单个样品中15个最丰富的细菌科的相对丰度(%)。样本按饮食干预进行分割，并按时间点进行分类。

  (D) 饮食干预后P. intestinalis(浅红色)和P. rodentium(浅蓝色)的动态相对丰度(%)。 中心代表平均值，误差条显示 ± SEM(n = 4 只动物/组)。

  (E-H)补充复合多糖后，肠内P. intestinalis and P. rodentium之间的竞争。

  (E)P. intestinalis and P. rodentium.纵向竞争实验设计。

  (F)ADONIS检验方差效应量和Bray-Curtis距离PCoA方差效应量。

  (G)来自 SPF_hzi 小鼠的粪便样本中 P. rodentium和P. intestinalis的相对丰度 (%)，喂食受控半合成饮食 (Synth-LF)并补充了3种复合多糖之一(细胞、纤维素;Pec、果胶;WAX、小麦-阿拉伯木聚糖)，每次处理 n = 4只动物。* p < 0.05(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)。

  (H)在不同剂量的WAX补充过程中，P. intestinalis versus P. rodentium的相对丰度 (%)。 Ctrl (Synth-LF+H2O)与WAX(在饮用水中添加10g/l和20g/l)相比。n =每次处理7–10只动物。* p < 0.05(Mann-Whitney U 检验)。

  (A) 每个个体中 P. copri MAG 的相对丰度 (%)。通过基于基因组的系统发育鉴定P. copri MAG及其进化枝特征(个体数 n = 101；图 S5)。

  (B) 在 P. copri MAG 中使用串联重复 susC/D 基因 (trsusC/susD)预测PUL的示意图。

  (C,D)分离的小鼠普雷沃菌和重建的P. copri MAGs的susC (C)和susD (D)氨基酸序列的系统发育树。每棵树都使用RAxML算法构建，有1000个bootstrap复制。以具有良好特征的卵形拟南芥阿拉伯木聚糖利用体系为参考。该系统由包含trsusC/D 的大 PUL (XylL) 和包含一对susC/D元素的短PUL (XylS)组成。有颜色的树枝(紫色，susC；橙色，susD)突出了B. ovatus(恒星)参考序列的拓扑结构，顶端的彩色形状代表基因组/MAG源。

  (E) 编码trsusC/D(+)与trsusC/D(-)的P. copri MAGs相对丰度(%)。*p < 0.05 (t检验)。

  MAGs相对丰度的Box-plot及其与寄主饮食习惯的关系。*p < 0.05 (Mann-Whitney U检验)。