背景：副溶血性弧菌是全球公认的食源性肠胃炎的病因，在全球海洋和沿海环境中广泛传播。副溶血性弧菌最主要具致病性的毒力因子是耐热直接溶血素(TDH)和耐热相关溶血素(TRH)。因此，该研究的主要目的是通过使用免疫磁分离(IMS)结合显色弧菌琼脂培养基、PCR靶向物种水平的toxR基因和毒力基因，调查沙特阿拉伯东部省沿海水域中是否有毒副溶血性弧菌的存在。

  目的：(i)通过在样品处理中使用IMB，在富集过程后浓缩细菌，从海岸水中分离副溶血性弧菌;(ii)通过使用靶向toxR基因的PCR将副溶血性弧菌的所有分离株确认为物种水平;(iii)使用PCR检查所有toxR基因阳性分离株的tdh和trh基因的存在;以及(iv)通过使用肠道细菌重复基因间一致性(ERIC)-PCR，对从沙特阿拉伯东部省沿海不同地点分离的副溶血性弧菌toxR基因阳性的所有分离株进行基因型分析，以获得相对遗传相似性。

  方法：从五个地点采集192份海水样品，并用碱性蛋白胨水(APW)肉汤进行浓缩。将来自APW中富集样品的一毫升部分与涂有针对副溶血性弧菌多价K抗血清的特异性抗体的免疫磁珠(IMB)混合，并与捕获的细菌分离。

  结果：在192份受检海水样品中，38份(19.8%)和44份(22.9%)副溶血性弧菌呈阳性，分别在TCBS琼脂和CaV培养基上产生绿色和淡紫色菌落。在该研究中分离的120株副溶血性弧菌分离株中，分别有3株(2.5%)和26株(21.7%)未经IMB处理和经IMB治疗的副溶血弧菌分离物的毒素调节(toxR)基因检测呈阳性。对已确认的toxR基因阳性菌株的筛选显示，在使用IMB和未使用IMB处理的菌株中，分别有21(17.5%)和3(2.5%)对耐热直接溶血素(tdh)编码基因呈阳性。

  副溶血性弧菌的耐热相关溶血素(trh)基因检测均为阳性。该研究发现，如果在环境样品的二次富集步骤中使用IMB浓度处理，则CaV培养基与TCBS琼脂相比没有优势。肠道细菌重复基因间一致性(ERIC)-PCR DNA指纹分析显示出高度的基因组多样性，将18株副溶血性弧菌分为4个相同的ERIC克隆群模式。

  结论：该研究报告首次在沙特阿拉伯东部省的沿海水域检测到产生tdh的副溶血性弧菌。

  使用靶向toxR基因的PCR进行副溶血性弧菌物种水平的确认。如表1所示，使用引物序列对所有分离的带有和不带有IMB的副溶血性弧菌分离株进行了toxR基因扩增子(大小368bp)的筛选。

  水的物理参数和副溶血性弧菌的免疫磁珠分离

  基于用IMB和未经IMB富集处理分离的TCBS和CaV琼脂上绿色和淡紫色菌落的初步外观，样品被认为对副溶血性弧菌呈阳性。检测样品中，在富含IMB的样品中检测到副溶血性弧菌阳性样品的数量最高，在不含IMB的样本中检测到最低(表2)。如表2所示，在CaV培养基上用IMB分离的副溶血性弧菌的阳性样本分布率最高的是HMF 19(48.7%)和AZB海滩15(37.5%)。而在TCBS琼脂上用IMA分离的副溶血性弧杆菌的阳性样本率最高的分别是HMF和AZB海滩的17(43.7%)和11(27.5%)(表1)。在用碱性蛋白胨水肉汤浓缩并在二次浓缩中未使用IMB处理的总共192份海水样品中，TCBS琼脂和CaV琼脂分别报告了3份(1.6%)和5份(2.6%)副溶血性弧菌阳性(表2)。在用IMB富集后，来自所有位置的TCBS和CaV琼脂上的副溶血性弧菌阳性样本数分别为38(19.8%)和44(22.9%)(表2)。

  分别在TCBS和CaV琼脂上用IMB分离出48株和58株副溶血性弧菌(表2)。在五个地点中，从HMF中分离出的副溶血性弧菌分离株数量最高(表2)。在二次富集过程中使用IMB后，在TCBS和CaV琼脂上从所有位置检测的样品中回收了大量副溶血性弧菌分离物(表2)。在这方面发现，使用IMB对检测的海水样品进行二次富集可以成功地在CaV和TCBS琼脂上回收副溶血性弧菌的典型菌落，优于将样品置于CaV和TCBS琼脂而不使用IMB进行二次浓缩的情况。

  使用靶向toxR基因的PCR确认副溶血性弧菌的物种水平

  为了更准确地确认副溶血性弧菌在物种水平上的鉴定，并出于比较目的，使用IMB分离的共120株副溶血性弧菌用物种特异性引物进行PCR(表1)。在120个副溶血性弧菌分离株中，通过368bp片段的扩增判断，3个(2.5%)和26个(21.7%)副溶血性弧菌分离株(无IMB和有IMB)的toxR基因呈阳性(图2)。

  毒力基因标记的检测

  在总的副溶血性弧菌toxR基因阳性中，有24株(20%)扩增了251bp的tdh片段，从HMF中检测到最多的tdh阳性分离株(图3)。如表3所示，21株(17.5%)副溶血性弧菌的tdh基因阳性分离株是通过IMB富集分离的，只有3株(2.5%)副溶血性弧菌tdh基因阴性分离株是在没有IMB富集的情况下分离的。没有一株副溶血性弧菌的trh基因检测呈阳性(表3)。

  分子分型

  在29株toxR基因阳性的副溶血性弧菌分离株中，使用ERIC-PCR DNA指纹分析对24株分离株进行了基因分型，并在副溶血性弧菌的分离株中产生了较高的基因组多样性。ERIC引物组产生4至10个指纹带，范围在100至1200 bp之间(图4)。在24个副溶血性弧菌基因型分离株中，18个分离株被分组并鉴定为4个ERIC相同的克隆群模式(簇1、簇2、簇3和簇4)，同时应用了100%的相似性截止值，6个分离株显示了单个簇(表4和图5)。在这四个簇中，簇二由2018年3月至4月期间从AZB、HMF和KBC 滨海分离的具有相同克隆起源的副溶血性弧菌分离物数量最多(图5)。

  结论

  研究得出结论，如果在环境水样的富集过程中使用IMB，TCBS和CaV琼脂都是分离副溶血性弧菌的合适的选择性培养基。因此，使用IMB将副溶血性弧菌与环境样品中的弧菌和其他非弧菌物种分离，并提高副溶血性弧菌的分离水平。该研究还得出结论，如果用涂有特异性多价K抗血清抗体的IMB处理富集样品，则CaV琼脂与TCBS琼脂相比没有优势。该研究中分离的tdh阳性副溶血性弧菌确定了公共卫生风险，并表明该基因有可能在海洋环境中传播。