导读：c-di-GMP是细菌生物膜形成过程中可逆的粘附过程中的中央调节因子，并且首次在假单胞菌中发现。其具体调控结构如下图1所示，LapD具有EAL和GGDEF结构域，EAL在无C-di-GMP的情况下，EAL结构域会封闭GGEDF结构域，LapG被释放，导致其将粘附素释放;当存在C-di-GMP的条件下，会形成LapD的二聚体，其构象发生改变，将LapG固定在二聚体直接，从而不能发挥其酶切活性，LapA将连接在细胞外膜上，从而实现粘附，增强生物膜的形成。

  图1、霍乱弧菌LapD及其作用机制

  通过将霍乱弧菌和假单胞菌的LapD和LapG进行对比，发现它们的相似度只有27%和50%，其相似度不高，我们重新对其进行模拟预测。可以发现，其也均有EAL和S螺旋的结构域，发现这些位点是相对保守的，并且EAL结构域可以屏蔽S helix。

  图2、LapD的C-di-GMP的结合位点及其相对保守的结构域

  通过SEC-MALS来确定这些结构域之间的聚合，发现存在C-di-GMP的条件下为二聚体，而无C-di-GMP的条件下为单体。通过为LapD进行点突变，其聚合体结构如图3所示，可以发现，野生型的在存在C-di-GMP的情况下，会形成二聚体，而当R248A位点突变后，会发现LapD恢复为单体，而R423A突变则不会有影响。

  图3、测定LapD的二聚化的状态

  前期的生物信息学推测FrhA和CraA有与其结合的位点，它们的结构域如图所示，CraA的N末端可以被LapG进行切割。对其活性进行测定，可以发现LapG能够切割FrhA和CraA的N末端，但是对FrhA的效果更好。

  构建如图C所示报告系统，可以发现作用的区域是AAAG或PAAG，当将AAAG转变为ARRG(PAAG变化PRRG)，其水解作用消失，使得肽段对LapG不敏感。

  图4、霍乱弧菌LapG是一种钙依赖性蛋白酶

  为了了解c-di-GMP对FrhA和CraA的调节，使用转录报告基因测定其表达量，结果如图5所示，可以发现无论在对数生长期还是在稳定期，c-di-GMP都可以被诱导表达，但是，frhA在对数生长期不受c-di-GMP的调控，二在稳定期受到c-di-GMP的调控，其表达量显著提高。carA无论在对数生长期还是在稳定期都受到c-di-GMP的调控。

  图5 c-di-GMP对frhA和craA表达的影响

  c-di-GMP通过特定的c-di-GMP受体的调节转录，在VC中，目前已有人研究发现VpsR、VpsT和FlrA能结合C-di-GMP。对这些基因进行敲除，检测其对frhA和craA的影响。如图所示，在对数生长期，这些基因的敲除不影响frhA的表达，但是在稳定期，frhA敲除会显著影响到frhA的表达，会使其表达量增加。对于craA而言，我们可以发现，vpsR会显著影响到craA的表达，是一个关键的调控因子。

  图6 不同的C-di-GMP对frhA和craA的表达

  继续研究了LapDG/C-di-GMP对于血凝的作用，结果如图7所示，发现大部分基因的敲除对于其血凝现象无影响，但是mshA的敲除则有显著的降低作用，作者怀疑这个是有菌株特异性，使用经典菌株O395,如图所示，LapG的敲除会使其血凝性显著增加，而frhA的敲除则会使其直接丧失血凝性。

  图7 LapDG系统调节血凝作用

  参考文献：Kitts G, Giglio KM, Zamorano-Sánchez D, Park JH, Townsley L, Cooley RB, Wucher BR, Klose KE, Nadell CD, Yildiz FH, Sondermann H. A Conserved Regulatory Circuit Controls Large Adhesins in Vibrio cholerae. mBio. 2019 Dec 3;10(6):e02822-19. doi: 10.1128/mBio.02822-19.