摘要：随着环境接触感染的快速增长，越来越多的人关注通过护理点检测(POCT)对冷链食品上的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)进行精确和绝对定量。在这项工作中，我们提出了一种水凝胶介导的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)，用于SARS-CoV-2的超快和绝对定量。交联水凝胶为纳米受限空间中的数字单分子扩增提供了机会，促进了病毒裂解、RNA逆转录和扩增过程，这比传统的大体积RT-LAMP快约3.4倍。SARS-CoV-2的超快速定量在15分钟内完成，无需病毒预裂解和RNA提取。灵敏度可精确定量SARS-CoV-2至0.5 copy/μL。此外，该集成系统具有优异的特异性、再现性和稳定性，也可用于在各种冷链水果上测试SARS-CoV-2。研发出的超快简单水凝胶RT-LAMP将在环境、农业和食品工业中监测病毒或其他有害微生物方面具有巨大潜力。

  凝胶RT-LAMP原理

  图中说明了水凝胶RT-LAMP测试SARS-CoV-2的集成护理点检测系统。将包含样品、水凝胶单体和RT-LAMP试剂的反应混合物装入芯片中，进行交联和凝胶化(～1 分钟)。两种水凝胶单体通过Michael加成反应交联形成多孔水凝胶网络。交联后，单个RNA分子或单个病毒可以随机限制在水凝胶网络中，而反应试剂通过纳米多孔通道自由扩散。随后，在加热块上加热水凝胶芯片以进行数字等温扩增。在这个阶段，RNA可以通过逆转录酶转化为RNA-cDNA杂交体，这可以通过Bst 2.0聚合酶的链移位和延伸进一步扩增。扩增产物在纳米限制空间中积累，产生一系列用于SARS-CoV-2数字量化的荧光点。阳性点的数量反映了样本中病毒的准确数量。

  用于SARS-CoV-2 RNA定量的超快凝胶RT-LAMP

  图中为水凝胶RT-LAMP系统的制备。图(a)可以看出随着水凝胶浓度的增加，扩增子被进一步限制，点大小逐渐减小。图(b)的复合模量结果表明交联凝胶化保持在65 oC，而图(c)显示出水凝胶基质即使在80 ℃仍然可以保持稳定。此外，检测时间是预防和控制新冠肺炎疫情的关键因素。图(d)为使用四组针对SARS-CoV-2N基因不同区域的引物来探索凝胶RT-LAMP系统的超快扩增。实时扩增曲线显示，所有引物的荧光强度在8 min 时呈现上升趋势，其中引物2具有最高的扩增效率，其被选择用于后续实验。如图(e)所示， SARS-CoV-2的水凝胶计数在10 min时达到最大，这与图(f)的凝胶扩增曲线一致。图(g)为不同放大时间下的终点荧光图像。图中可以看出，随着反应时间的延长，荧光点数量没有进一步增加，只有扩增子尺寸变大。

  SARS-CoV-2超快速检测机制

  与水性RT-LAMP相比，凝胶RT-LAMP可以实现SARS-CoV-2 RNA的超快检测，并探讨了增强扩增的原因。对于RT-LAMP过程，RNA应首先经历反向转录，以成为与双链DNA结构类似的RNA-cDNA杂交体。因此，研究了与SARS-CoV-2N基因互补序列的双链DNA和单链DNA片段的实时扩增曲线。如图(a)所示，对于双链DNA，观察到类似的现象，水凝胶中的LAMP过程是超快的，而水溶液中的LAMP过程被抑制。与凝胶-LAMP的Tt值为5 min相比，水溶液中的时间为20 min。图(b)为单链DNA段的实时扩增曲线，图中可以看出，凝胶和水溶液体系中并无很大的差异。图(c)为无SYBR Green条件下高模板浓度(103 copies/μL)的SARS-CoV-2 RNA的RT-LAMP水溶液凝胶电泳。众所周知，SYBR Green是一种嵌入染料，它可能与双链DNA和RNA-cDNA杂交体结合，而其与单链DNA的亲和力很低。因此，SYBR绿色染料的嵌入将影响双链DNA和RNA的扩增过程，而对单链DNA的影响较小。为了验证影响水溶液和凝胶中RNA扩增的原因，进行了更详细的研究，以探索SYBR Green染料的作用和水凝胶的功能。图(d)为当向反应中加入不同浓度的SYBR Green时，水性RT-LAMP测定显示Tt值增加(8–34 min)，而水凝胶中的Tt值保持不变(～4 min)。这些结果证实了染料在常规RT-LAMP水溶液中的抑制作用。而这些嵌入染料通常带正电，而PEG水凝胶带负电。因此，由于SYBR Green吸附在水凝胶表面上，水凝胶基质可以保护RT-LAMP反应免受干扰。其中，图(e)为通过紫外-可见吸收光谱对吸附情况的证明。此外，理论模拟还使用Materials Studio软件证实了水凝胶和SYBR Green染料的吸附。如图(g)-(i)所示，PEG水凝胶和SYBR Green的结合能计算为− 337.00977 kJ/mol(<0)，证实了染料与PEG水凝胶之间的自吸附。即使不包括SYBR Green，纳米受限水凝胶中的RT-LAMP扩增仍比溶液中的增强。如图(f)所示，在此测试了SARS-CoV-2 RNA的低模板浓度(10 copies/μL)，水凝胶中的RT-LAMP成功地进行了清晰的条带，而水溶液中的RT-RAMP完全失败，即使不含染料。(第1-2行：水溶液RT-LAMP和凝胶RT-LAMP的阴性组。第3-4行：水溶液RT-LAMP和凝胶RT-LAMP阳性组。M： 2000年 bp DNA marker)。图(j)为SARS-CoV-2 RNA的超快检测机制图。图中可以看出，荧光染料可以在系统中与RNA-cDNA杂交结合，这显著降低了扩增效率，并推迟了Tt值。然而，由于水凝胶的纳米限制效应和水凝胶网络与染料之间的强结合力，凝胶RT-LAMP中的扩增不受影响。外引物的链位移、环状结构的形成和循环扩增都在水凝胶的纳米约束环境下保持。大量的产物稳定并积累在水凝胶RT-LAMP中，与本体RT-LAMP相比，扩增时间大大缩短。

  SARS-CoV-2病毒的超快速定量

  除了超快的RT-LAMP过程外，SARS-CoV-2常规测试中通常还需要病毒裂解和RNA纯化，因为蛋白质外壳的存在会影响RNA逆转录和扩增过程。然而，裂解和纯化过程将显著增加检测时间和操作复杂性。使用开发的水凝胶RT-LAMP系统可以实现SARS-CoV-2病毒的直接定量而无需预裂解。图(a)为SARS-CoV-2病毒的TEM图像，完整的蛋白质外壳很明显。如图(b)所示，SARS-CoV-2病毒的超快扩增可以在凝胶RT-LAMP中保持。然而，随着Tt值从17分钟增加到32分钟的过程中，病毒在RT-LAMP水溶液中的扩增曲线与检测其提取的RNA相比受到更大的抑制。因此，蛋白质外壳将是影响扩增效率的另一方面。图(c)表明，由于蛋白质壳的存在，SARS-CoV-2在基于商业溶液的液滴数字RT-LAMP系统中的单病毒扩增效率降低，而凝胶RT-LAMP中的扩增效率没有受到影响。因此，水凝胶中的纳米限制效应有利于在没有预处理的情况下直接定量SARS-CoV-2病毒。使用SARS-CoV-2病毒的浓度系列评估水凝胶RT-LAMP系统，以探索定量性能。为了进行比较，通过标准数字PCR测定获得样品中准确的SARS-CoV-2浓度。如图(d)和(e)所示，可以清楚地观察到低至0.5 copies/μL的荧光点。随着SARS-CoV-2病毒浓度的增加，阳性点逐渐增多。在最终浓度范围为0.5至271 copies/μL的情况下，准确观察到五组。如终点荧光图像所示，在阴性对照中未检测到荧光。终点荧光计数与预期值之间的相关性很高(R2=0.9999)。因此，通过开发的水凝胶RT-LAMP对SARS-CoV-2病毒的定量是超快、精确和绝对的。灵敏度水平可以准确量化0.5 copies/μL 的SARS-CoV-2病毒，这比迄今为止报道的大多数工作都出色。

  水凝胶RT-LAMP的性能评价

  SARS-CoV-2N基因是一个高度保守的区域，是诊断所必需的片段。如图4a，只能检测到SARS-CoV-2 N基因区。因此，与其他SARS-CoV-2E基因和ORF8基因或其他病毒(甲型流感病毒和诺如病毒)、细菌和植物病原真菌基因组相比，凝胶RT-LAMP对SARS-CoV-2N基因具有优异的特异性。此外，如图(b)所示，预混合分析可稳定储存至少7个月，这为商业试剂盒和护理点检测提供了突出的潜力。

  真实样本的分析

  由于存在来自水果的各种抑制剂，如蛋白质、多糖和多酚，核酸扩增可以被抑制，测试了带有人工掺入SARS-CoV-2的冷链水果的表面和基质。实际水果和果汁的照片如图(a)-(b)所示。为了评估凝胶RT-LAMP试验在耐受果汁基质抑制剂方面的性能，我们分别将龙眼、猕猴桃、火龙果和樱桃汁加入系统中。终点荧光图像和放大曲线如图(c)和(d)所示，在所有果汁组以及对照组中都清楚地观察到荧光点。在传统的实时定量方法中，樱桃和猕猴桃的Tt值存在延迟，这可能是由两种水果中的酸性成分引起的。因此，实时核酸扩增的定量能力在实际样品基质的护理点检测分析中受到质疑。然而，对于凝胶系统中的终点数字计数，阳性点的数量没有受到影响。因此，凝胶RT-LAMP对多种冷链水果基质的抑制剂具有耐受性。

  结论

  1、本研究报道了一种水凝胶介导的RT-LAMP，用于冷链水果上SARS-CoV-2的快速和绝对定量。

  2、水凝胶基质对染料和细胞碎片具有很强的吸附性，并且在从荧光染料和病毒外壳蛋白中分离SARS-CoV-2 RNA方面具有独特的优势。

  3、SARS-CoV-2病毒的超快速检测可以通过所开发的无RNA提取的水凝胶测定来实现，这比RT-LAMP水溶液中的检测速度快约3.4倍。

  4、所开发的测定具有高的特异性、重复性和储存稳定性。0.5 copies/μL 的SARS-CoV-2可在15 分钟内得到定量。

  5、SARS-CoV-2可以在实际的冷链水果中进行监测，包括龙眼、猕猴桃、火龙果、樱桃和香蕉。

  6、本研究中所开发的凝胶RT-LAMP可能是SARS-CoV-2或其他病原体的定点检测的一种有前途的工具，以确保临床、环境和食品安全。

  参考文献

  Yang, T., Li, D., Yan, Y., Ettoumi, F.-e., Wu, R. A., Luo, Z., Yu, H., & Lin, X. (2023). Ultrafast and absolute quantification of SARS-CoV-2 on food using hydrogel RT-LAMP without pre-lysis. Journal of Hazardous Materials, 442, 130050.