2023年1月发表在《Food Microbiology》上的《Quantification of hepatitis E virus in raw pork livers using droplet digital RT-PCR》一文建立了RT-ddPCR检测生猪肝戊型肝炎病毒(HEV)的方法，HEV RNA检测的检测限低至1.81copies/μL。建立的方法在14个样品上进行了验证，显示出比RT-qPCR更高的灵敏度、特异性和抗干扰性能特征。此外，通过嵌套RT-PCR扩增部分ORF2基因，并对HEV RNA阳性样品进行测序。

  HEV是导致戊型肝炎疾病的病原体。HEV可能通过粪口途径通过直接接触受污染的饮用水或未煮熟的食物传播，特别是来自猪肉、野猪和鹿的食物。目前可用于HEV检测的最有效方法是RT-qPCR，它利用循环阈值(Ct)值来获取定量信息。然而，这些Ct值很容易受到样品中抑制性化合物的存在、逆转录和仪器特定变量的效率以及需要使用标准样品校准样品的影响。与qPCR相比，ddPCR对微量的PCR抑制剂不太敏感，无需标准曲线即可获得目标核酸的绝对定量，并且在低浓度下显示出更好的重复性。作为PCR的补充技术，ddPCR已广泛应用于各个领域。

  下面将主要简述RT-ddPCR检测方法的建立，以及用于对河北省不同产地获得的HEV RNA进行绝对定量。

  1. RT-ddPCR 测定的优化参数

  图1 HEV RT-ddPCR的优化

  为了确定最佳退火温度，评估了62 °C–48 °C的温度梯度，可以明显分离正(蓝色)和负(灰色)液滴，并且在50.7 °C时产生最多的正液滴(图1A)。接下来，通过分别评估500–1100 nmol/L和150–450 nmol/L范围内的引物和探针浓度的不同组合来优化引物和探针的浓度。当反应体系中的引物为900 nmol / L，探针为350 nmol / L时，阴性(灰色)和阳性(蓝色)液滴可以明显分离，并且产生的正液滴数量最多(图1B)。重复3次得到相似结果，最佳退火温度为50.7 °C，引物和探针的最佳浓度分别为900 nmol/L和350 nmol/L。

  2. HEV RT-ddPCR 的性能

  图2 HEV RT-ddPCR的分析灵敏度

  检测限(LOD)定义为95%的检测率最低模板浓度。该测定基于10次重复的结果，所有10个重复在浓度超过3.4 copies /μL时均为阳性(图2A)。概率回归分析(图2B)显示，测定的LOD以95%的概率确定为1.81copies/μL。

  3. 生猪肝中HEV的检测

  图3生猪肝样本通过RT-ddPCR和qRT-PCR检测HEV的结果

  共分析了626份生猪肝样本。结果表明，在RT-ddPCR中检测到14个样品(2.24%)HEV RNA，而qRT-PCR中12个样品(1.91%)也检测出HEV RNA阳性(图3)。qRT-PCR和RT-ddPCR之间存在高度一致性，表明开发的HEV特异性RT-ddPCR检测方法与临床样品上的qRT-PCR具有相似的诊断性能.

  4. 总结

  综上所述，本研究开发的RT-ddPCR是一种准确灵敏的生猪肝中HEV RNA绝对定量的方法，特别是在病毒载量低的样品中。该RT-ddPCR检测方法能够准确检测HEV病毒载量，对猪群和猪肉相关食品HEV感染的精准防控具有重要意义。

  参考文献：

  [1] Wang K, Liu L, Wang J, Sun X, Han Q, Zhou C, Xu X, Wang J. Quantification of hepatitis E virus in raw pork livers using droplet digital RT-PCR. Food Microbiol. 2023 Feb;109:104114. doi: 10.1016/j.fm.2022.104114.