人类星状病毒(HAstV)是一种非常流行但研究不足的肠道病毒。它们被认为是儿童急性胃肠炎的主要原因之一，占感染的2% - 9%。此外，有报道称它们与免疫缺陷儿童的中枢神经系统并发症如脑膜炎、脑炎和急性弛缓性麻痹(AFP)相关。HAstV基因组的长度通常在6.2 ~ 7.9 kb之间，包含三个开放阅读框(ORFs): ORF1a和1b编码非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白。传统上，HAstV被分为8种血清型，从HAstV -1到HAstV -8，现在称为classic HAstV。最近，下一代测序(NGS)的应用导致发现了各种新的星状病毒，这些病毒在基因上与classic HAstV高度不同。目前，HAstV被分为4种：MAstV-1 (HAstV-1 8)，MAstV-6 (MLB1 3)，MAstV-8 (VA2，VA4和VA5)，以及MAstV-9 (VA1和VA3)。

  在中国，2009年至2018年期间对全国所有年龄急性腹泻患者的前瞻性监测显示，HAstV是排在轮状病毒A、诺如病毒和腺病毒之后的前四大病毒病原体，阳性率为7.18%。由于肠道病毒可从感染者排泄到污水中，对生活污水进行检查可能是了解这些病毒实际流行情况的有效方法。

  近年来，随着NGS技术的不断发展，病毒宏基因组学研究取得了很大进展。该研究开发了一种NGS法捕获污水中HAstV的完整ORF2序列。对2018 - 2019年济南市污水中典型和新型HAstV的多样性和系统发育特征进行了调查，以期发现可能的新毒株，提高对HAstV循环的认识。

  污水中HAstV基因组的定量分析

  通过qPCR检测，2018年1月至2019年12月收集的24份污水样品均为HAstV RNA阳性，春季采集的样本浓度最高。

  图1 2018年1月至2019年12月污水中classic HAstV、HAstV- VA和HAstV- mlb浓度。图A显示了每个样品的浓度，图B显示了不同季节的几何平均值。

  污水中HAstV RNA的ORF2扩增

  常规RT-PCR法均成功扩增出HAstV核酸。使用classic HAstV、HAstV- mlb和HAstV- VA引物进行PCR反应，阳性率分别为100.0%(24/24)、79.2%(19/24)和62.5%(15/24)。

  58个扩增子分别用NGS分析。每个样本中星状病毒的reads比例如图2所示。classic HAstV、HAstV- mlb和HAstV- VA反应产生的扩增子在星状病毒上的reads分别占13.4% - 99.4%、23.4% - 92.3%和5.4% - 74.1%。

  图2 2018 - 2019年收集的污水样本中星状病毒的reads比例。图A、B和C分别为classic HAstV、HAstV- mlb和HAstV- VA的PCR扩增结果。

  classic、MLB-和VA- hastv的基因型多样性

  通过58个扩增子分析，24份污水样品共检测到18种星状病毒，包括classic HAstV(基因型1、2、3、4、5、8)、HAstV- mlb(1、2株)、HAstV- VA(1、6株)和非人类的MAstV(猫、犬、猪和啮齿动物AsV)。其中，7种(HAstV-1、2、4、5、VA1、VA2和VA3)在所有污水样品中均检出。VA6是该研究新发现的毒株。该研究获得了VA6的10条全长ORF2序列。与2株VA5参考株VA5/human/Gambia/102，139/2009和BF34之间核苷酸同源性分别为98.1% - 99.9%和82.9% - 83.2%和82.3% - 83.3%。与其他毒株或基因型没有更密切的遗传关系。根据上述分类标准，作者提出了新毒株VA6。

  用classic HAstV引物集生成的24个扩增子均观察了上述18种星状病毒。80.02%属于classic HAstV，19.30%属于HAstV- VA，0.64%属于非人类的MAstV，其余0.0064%属于HAstV- mlb。如图3A和3B所示，以HAstV-5、1和2最为丰富，分别占总星状病毒reads的27.87%、23.45%和14.97%。

  在使用HAstV-MLB引物集产生的19个扩增子中，只有11个星状病毒从NGS数据中被鉴定出来。98.53%属于HAstV- mlb(毒株1和2)，1.24%属于classic HAstV(基因型1-5)，0.23%属于非人类的MAstV(猫和啮齿动物AstV)，其余0.0038%属于HAstV- VA(毒株2和3)(图3C和D)。

  用HAstV-VA引物集扩增出15个扩增子，从NGS数据中鉴定出11个星状病毒。99.99%属于HAstV- VA(毒株1-6)，0.010%属于classic HAstV(基因型1、2、4和5)，其余0.00010%属于非人类的MAstV(啮齿动物AstV)(图3E和F)。

  图3 污水样品中星状病毒基因型分布。图A、C和E分别为用classic HAstV、HAstV- mlb和HAstV- VA引物组PCR检测污水中不同星状病毒组成比值的对数结果。B、D、E左侧面板分别显示不同星状病毒基因型的reads总数和构成比。

  同源性比较和系统发育分析

  系统发育分析显示，classic HAstV、HAstV- mlb和HAstV- VA有3个主要的进化支，并进一步划分为14个系统发育组(图4)。每个组指定一个classic HAstV基因型或一个新毒株。在HAstV-VA和MLB1的分支中，山东序列占绝大多数，只有很少一部分参考序列来自世界其他地区。特别是VA6是该研究中新发现的毒株，该进化枝仅由中国的序列组成。

  图4 利用MEGA 11.0的Neighbor-Joining方法建立星状病毒ORF2全序列的系统发育树。进化距离用木村2参数法计算，以每个位点的碱基替换数为单位。本次分析涉及451条核苷酸序列，其中包括该研究中获得的273条序列(分类单元名称用红色表示)和178条来自GenBank的序列。

  结论

  该研究建立了一种基于NGS的污水样品中HAstV RNA的检测和鉴定方法。通过这种方法，从2018年至2019年收集的污水样本中发现了18种星状病毒，包括一种新型毒株VA6。结果显示，污水中含有相当多种类的星状病毒。基于NGS的环境监测大大提高了作者对HAstV流通的了解。

  参考文献：

  Tao Z， Lin X， Liu Y， et al. Detection of multiple human astroviruses in sewage by next generation sequencing[J]. Water Research， 2022， 218: 118523.