人畜共患致病菌所携带的毒力基因(Virulence factor genes，VFGs)是存在于环境中的潜在风险。近日，中科院生态环境研究中心土壤环境科学与技术实验室朱永官院士团队基于SmartChip Real-Time PCR System开发了一种新的高通量qPCR芯片(HT-qPCR)，称为VFG-chip，用于环境中致病菌毒力基因的高通量检测，此研究成果发表在环境领域主流期刊Environment International上。

  环境中的致病菌及其迁移扩散会导致一些人畜共患疾病，威胁全球公众健康和生态安全。致病菌携带的VFGs是一种具有微生物性质的新型污染物，具有潜在的健康风险与生态风险。然而，现有的VFGs检测方法主要是基于传统的单靶标PCR或qPCR扩增，因受到技术限制，难以实现多种VFGs的快速高通量检测;尽管宏基因组学已被应用于毒力因子(Virulence factors，VFs)的分析检测，但此方法存在成本消耗高，数据分析处理复杂以及其测序结果无法验证的问题。已发展的杂交微阵列“Pathochip”也只针对13个VFGs，且所需的杂交时间长达16小时，同时，在分析前进行微阵列杂交需要清洗和扫描，操作繁琐。综上，现有的VFGs检测方法受限于通量和成本，无法在一次实验中实现对环境样本中的大量VFGs的同时检测。因此，开发一种高通量检测技术，提高VFGs的检测效率，促进人畜共患致病菌的风险评估，仍是科研人员的一个主要攻克方向。 为此，中科院朱永官院士团队基于高通量qPCR(HT-PCR)技术建立了VFG-Chip，用于环境中4种典型人畜致病菌VFGs的检测，这四种致病菌包括：肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae，K.Pn);鲍曼不动杆菌(A.baumannii，A.ba);大肠杆菌(E.coli，E.co);肠道沙门氏菌(S.enterica，S.en)，其检测组及开发VFG-Chip的主要工作内容详见图1。展开来讲，研究的工作内容包括两部分内容，1)查阅保守基因序列、相应引物以及引物设计;2)方法的特异性验证;灵敏度和LOQ值的表征;扩增效率的表征及HT-qPCR反应条件的优化;以及实际样本的应用。

  图1 VFG-Chip的主要工作基础及内容

  VFG-Chip共包含120对引物，包括87对新设计验证的引物和33对已发表的引物，针对编码78个VFs的96个VGFs，引物特异性通过观察熔解曲线峰图(单峰)得到验证，见图2。随后，作者利用浓度梯度稀释的质粒DNA样本获得了方法的灵敏度和最低检测限(图3)。在这里，也通过阴性对照(使用无菌水代替DNA模板)无任何阳性扩增信号证明了所选择的引物不存在二级结构的问题。另外，作者也表示PCR的扩增效率在0.95~1.02之间，平均为0.977，标准差为0.057，由此证明所设计的VFG-Chip对靶向特异性VFGs基因具有良好的特异性、灵敏度和扩增效率。随后，作者利用40例城市污水及土壤样本证明了VFG-Chip的实际应用能力(图4)。总的来说，基于SmartChip Real-Time PCR System开发的VFG-Chip可在2小时内一次性检测42个样品的毒力组(96个VFGs)，且大于91%的引物扩增效率为90%至110%，具有高效、快速、准确的显著性优势，为量化环境中致病菌毒力组提供了一种高效可靠的高通量检测手段，未来有望在致病菌毒力组特征及其健康风险与生态风险评估等相关研究中发挥重要作用。

  图2 引物特异性验证

  图3 利用10倍梯度稀释的质粒DNA样本验证120对引物的灵敏度。

  图4 环境样本中的VFGs丰度检测。

  原文链接：https://doi.org/10.1016/j.envint.2023.107761