肠道粘膜是肠道病原菌与宿主动态相互作用的第一场所，共生微生物区系在保护宿主肠道免受外源病原体感染中起着重要作用。然而，一些肠道病原体已经进化出逃避共生介导的定植抗性的策略。益生菌是活的共生微生物，它们是肠道的天然居民，当摄入适量时，可对肠道病原体产生拮抗作用并有益健康。虽然益生菌给宿主带来好处的确切作用机制尚不清楚，但有人提出，益生菌与病原体竞争黏附部位，改善微生物平衡，恢复上皮屏障功能，并增强上皮免疫反应从而避免感染。益生菌用于预防或治疗的主要局限性是它们在肠道的定植能力差，因此与病原体竞争和发挥免疫调节作用的能力较弱。为了克服传统益生菌的这些局限性，下一代生物工程益生菌菌株可以被设计成包含理想的特征，其中一种特征是益生菌菌株表达病原体特定的表面蛋白以优先结合宿主受体，阻止病原体与宿主的相互作用。

  食源性病原体单增李斯特菌(Lm)穿过肠道屏障，在新生儿、老年人和其他免疫功能低下个体中引起致命的全身感染(病死率为20-30%)。Lm还可以穿过血脑屏障，引起脑膜炎和脑炎，以及越过胎盘屏障，导致孕妇流产或死产。Lm克服了肠道相关的先天防御，非常适合在肠道的恶劣环境中生存，并能穿过肠道上皮屏障，其中李斯特菌粘附蛋白(Listeria adhesion protein，LAP)和细菌入侵蛋白内化素A(Internalin A，InlA)介导Lm穿越宿主肠道屏障的高度特异关键途径。LAP是一种管家酒精乙醛脱氢酶(Lmo1634)，存在于致病性和非致病性李斯特菌中。然而，LAP只在致病性李斯特菌中表现出毒力属性，因为LAP在非致病性李斯特菌上缺乏分泌和表面重新结合。LAP与其宿主受体HSP60的相互作用导致核因子-κB(NF-κB)的激活和核转位，进而导致肌球蛋白轻链激酶(myosin light-chain kinase，MLCK)的激活。激活的MLCK使肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化，使紧密连接蛋白、claudin-1蛋白和闭合蛋白以及粘着连接蛋白和E-钙黏素重新分布，导致细胞-细胞连接开放。因此，Lm通过操纵LAP-HSP60-NF-κB-MLCK轴，执行有效的跨肠屏障易位。

  Drolia R等之前曾证明，重组副干酪乳杆菌表达Lm的 LAP蛋白减少了Lm在体外的相互作用。然而目前还缺乏这种益生菌工程菌株的体内功能和保护的分子基础的证明。此外，来自致病细菌(Lm)的蛋白的表达可能会引起对这种工程益生菌菌株的健康或监管方面的关注。为此，Drolia R等在干酪乳杆菌(一种更常用的具有免疫调节作用的益生菌)的表面表达了来自非致病性李斯特菌(英诺克李斯特菌)的LAP蛋白。同时，还在干酪乳杆菌表面表达了Lm的LAP蛋白。结果表明，生物工程乳杆菌益生菌(bioengineered Lactobacillus probiotic，BLP)菌株在肠道内强有力地定植，极大地减少了Lm粘膜定植和全身传播，并保护小鼠免受致命感染(图1)。

  图1 免疫染色证实在感染了Lm的初次接受试验的小鼠或LbcWT治疗的小鼠中，Lm显著增加了对回肠(图1a)和结肠(图1b)固有层的穿透。相比之下，在BLP处理的小鼠中，Lm细胞仅限于上皮的管腔表面。

  BLP可通过占据宿主LAP受体热休克蛋白HSP60竞争性排除Lm、通过阻断因子-κB和MLCK激活、MLC磷酸化以及随后主要的上皮连接蛋白(Claudin-1、闭合蛋白和E-钙黏素)的重新分布改善Lm诱导的肠屏障功能障碍，防止Lm易位和感染，以维护肠上皮屏障的完整性。

  此外，BLP还通过招募肠道FOXP3+T细胞、CD11c+树突状细胞和NK细胞来增强免疫调节作用(图2)。

  图2 BLP通过调节免疫细胞数量来维持肠道免疫平衡

  研究结果表明，LAP在工程菌株中的表达不仅有助于BLP菌株与肠道上皮细胞的亲密接触，促进益生菌的增强和延长定植，而且还排除了Lm与宿主细胞的相互作用。在建立的对Lm感染高度敏感的A/J小鼠模型中，证明了BLP菌株而不是亲本LbcWT菌株在体外和体内显著减少了Lm的黏附、侵袭和易位，以减轻致命性的Lm感染。这种利用非致病细菌的黏附蛋白来设计益生菌菌株以排除病原体的方法，显着提高了这种生物工程益生菌的预防性使用，而不会引起严重的健康或监管问题，从而使它们成为李斯特菌病的防御剂。

  图3 BLP介导的预防李斯特菌病的机制的示意图

  BLP通过三种机制(1)竞争排斥、(2)改善肠道屏障功能和(3)接触性免疫调节来预防Lm感染。

  参考文献

  Drolia R, Amalaradjou MAR, Ryan V, Tenguria S, Liu D, Bai X, Xu L, Singh AK, Cox AD, Bernal-Crespo V, Schaber JA, Applegate BM, Vemulapalli R, Bhunia AK. Receptor-targeted engineered probiotics mitigate lethal Listeria infection. Nat Commun. 2020 Dec 11;11(1):6344. doi: 10.1038/s41467-020-20200-5. PMID: 33311493; PMCID: PMC7732855.