D-氨基酸抑制空肠弯曲菌生物膜的形成
原创 发布时间:2022-10-14 浏览次数: 1913 来源: 肖铠珊

核心提示:人类致病菌空肠弯曲菌是引起腹泻的主要食源性细菌,据世界卫生组织(WHO)统计,每年约有10%的世界人口感染空肠弯曲菌,对头孢菌素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、利福平、万古霉素等多种抗菌药物表现出内在耐药,被世界卫生组织列为开发新抗生素的优先病原体名单。


  人类致病菌空肠弯曲菌是引起腹泻的主要食源性细菌,据世界卫生组织(WHO)统计,每年约有10%的世界人口感染空肠弯曲菌,对头孢菌素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、利福平、万古霉素等多种抗菌药物表现出内在耐药,被世界卫生组织列为开发新抗生素的优先病原体名单。其中,生物膜可以增强许多病原体的耐药性。因此,最近对潜在抗菌剂的研究包括自然发生的小分子,如一氧化氮、脂肪酸和D -氨基酸(DAs)。DAs在体外具有分散某些细菌生物膜的能力。细菌产生DAs的能力被认为是老化生物膜的自扩散机制,在混合生物膜成熟过程中,产生DAs还可能抑制其他细菌的生长。DAs可以诱导基质相关淀粉样原纤维的分解,这些淀粉样原纤维连接生物膜内的细胞,并促进生物膜强度。一些DAs表现出抑制或毒性细菌物种的数量,可以干扰肽酶和蛋白酶的活动参与细胞壁的合成。这表明DAs可以形成一种潜在的抗菌膜剂。本研究探讨了D和L氨基酸单独或联合作用对空肠梭菌生物膜的抑制和分散作用,以及这些化合物增强D-环丝氨酸等抗生素疗效的能力,以及可能的抑制作用机制。

  LAs和DAs能抑制空肠弯曲菌生物被膜形成

  为了研究LAs和DAs对生物被膜形成的影响,测试了不同浓度的LAs和DAs (1-100 mM)对弯曲菌生物被膜的破坏或分散能力。采用两种方法,一种是测定生物膜抑制率(%)(抑制试验),另一种是测定对形成的生物膜分散的影响。


  图1 100 mM D -氨基酸(DAs)和L -氨基酸(LAs)对空肠弯曲菌-11168生物膜的影响。

  DAs处理空肠梭菌对生物膜形成有显著抑制作用(p < 0.001)。对LAs和DAs个体进行预筛选,发现4种氨基酸(D-ala、D-met、D-ser和D-trp)对空肠弯曲菌生物被膜的形成具有较强的抑制作用。除L-ala外,其余L形式的氨基酸均无抑制作用,而L-met和L-trp则显著增加了生物被膜的形成。DAs对生物膜的形成有很强的抑制作用。

  DAs对不同弯曲菌形成生物膜的影响

  为了阐明毒株特异性反应,空肠弯曲菌11168 和空肠弯曲菌 81 - 176,和大肠杆菌NCTC11366,被用来证实D-ala, D-ser, D-met, and D-trp 在10 mM的抑制效果。


  图2A空肠弯曲菌11168,B 空肠弯曲菌 81 - 176,和C)大肠杆菌NCTC11366生物膜抑制作用的定量分析

  D-ser和D-trp对空肠弯曲菌11168生物被膜形成的抑制作用最大,D-ala对81-176生物被膜形成的抑制作用最大和D-met对大肠杆菌生物被膜形成的抑制作用最大。

  DAs和LAs等摩尔混合物对空肠弯曲菌11168生物膜的影响

  考虑到D-ser或D-met在>1mM浓度下诱导生物膜扩散,而5 mM的L-ala、D-ser、D-met或D-trp对生物膜扩散有抑制作用,以DAs和LAs(1:1)等摩尔混合物作为评价指标。等摩尔混合物对空肠弯曲菌11168生物膜形成的抑制率≥40%。


  图3DAs和LAs等摩尔混合物对空肠弯曲菌11168-生物膜的影响

  这表明,即使在最低浓度下,DAs和LAs的组合使用也可能比单独使用DA或LA更有效。因此,评估了四种氨基酸的混合物,L-ala, D-met, D-ser, D-trp,这些氨基酸在5:5:2:5 mM组合更有效,可抑制高达49%的生物膜形成。但是,D-ala的添加降低了这种抑制作用。

  DAs在生物膜上分散效果的微观表征

  共聚焦显微镜显示,成熟的空肠弯曲菌11168生物膜具有具有淀粉样纤维的结构外观,并将生物膜内的细胞连接起来。


  图5 空肠弯曲菌11168和淀粉样纤维的成熟生物膜,利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对空肠弯曲菌菌生物膜进行双荧光标记成像

  单个DAs处理后形成的生物膜的显微镜检查显示,与未处理对照相比,生物膜的形成和淀粉样纤维的消失显著减少。


  图6 25mm DAs存在的空肠弯曲菌 11168生物膜共聚焦扫描激光显微镜图像。48小时后,用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对空肠菌生物膜进行双荧光标记成像。(a)未经处理 (b) D-ala, (c) L-ala, (d) D-ser, (e) D-met, (f) D-trp

  D-ala能逆转DAs和DCS的抑制作用

  有报道称D-ala可逆转DCS对分支杆菌的抗菌作用。考虑到最低抑制浓度(MIC)弯曲杆菌报道的DCS范围在0.25 - 4µg / mL,作者测试了亚抑制10 - 50 ng / mL的浓度。



  图7(A) d -环丝氨酸(DCS)、(B) L-ala和D-ser对空肠C. 11168-O生物膜抑制作用的逆转

  从图可知,DCS可以减少空肠增长和生物膜的形成高达60 – 76%,此外,这种效应可以抵消增加的浓度D-ala从10mM到50mM。D-ala与D-ser或L-ala结合也能降低生物膜形成的抑制。


  图8 DCS与L-ala、D-ser、D-met、D-trp (5:5:2:5 mM)混合作用对空肠弯曲菌11168-生物膜的影响

  相比之下,DAs与DCS联合使用时,浓度为10 ng/mL的DCS的疗效比单独使用DCS时提高了32%。

  结果与讨论:

  本研究描述了特定自然发生的DAs的活性,在预防和破坏空肠弯曲菌的生物膜方面非常有效, D-met和D-trp能抑制空肠梭菌生物被膜的形成,而这些氨基酸的l型显著增加了生物被膜的形成。这可能是空肠弯曲菌能够分解这些氨基酸的l型,从而促进细菌生长,从而形成生物膜。这与之前报道的Tyr、Leu、Trp的D型抑制枯草芽孢杆菌生长的作用,以及的l型抑制作用是一致的。但是,除D-met外,DAs对空肠梭菌生长的抑制作用可被D-ala逆转,与对枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌和大肠杆菌的抑制作用相似显微分析证实了DAs对空肠梭菌生物膜形成的影响,特别是生物膜基质内淀粉样纤维的形成。综上所述,(1)DAs对空肠梭菌生物膜形成具有毫摩尔浓度的抑制作用;(2) DAs可触发空肠菌生物膜的分解;(3) DAs联合应用可增强DSC的作用;(4) DAs通过抑制丙氨酸外消旋酶的表达,抑制空肠弯曲菌的生长和生物膜的形成。

  参考文献:Elgamoudi BA, Taha T, Korolik V. Inhibition of Campylobacter jejuni Biofilm Formation by D-Amino Acids. Antibiotics (Basel). 2020 Nov 23;9(11):836. doi: 10.3390/antibiotics9110836. PMID: 33238583; PMCID: PMC7700173.

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