解读中国药典2020年版三部/四部通则3301支原体检查（第一法培养法）
支原体是一类缺乏细胞壁，能通过滤菌器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核型微生物。
供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2℃～8℃;超过24小时应置-20℃以下贮存。
主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。
病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体。
一、培养基灵敏度检查(变色单位试验法)(CCU)
1.1 培养基(海博生物)
支原体液体培养基(支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基(27.52g/800mL)和相应的支原体半流体培养基(或支原体琼脂培养基)。
半流体培养基(或琼脂培养基)在使用前应煮沸10 ℃～15℃分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭菌小牛血清(培养基：血清为8 : 2)，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。
临用前800mL培养基加入 200ml马血清(培养基：血清为8:2)+80万单位青霉素。
1.2 检验方法
(1)将肺炎支原体ATCC 15531 第 代和口腔支原体ATCC 23714第 代接种于适宜的支原体培养基中，经 (36±1)℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内;口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置 (36±1)℃培养 (7～14)天，观察培养基变色结果。
(2)结果判定：以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体ATCC 15531应达到10-8，口腔支原体ATCC 23714应达到 10-4。
1.3 检验结果 (注：+ 表示变色，有支原体生长;一 表示不变色，无支原体生长)
| 测试菌种 | 接种培养基 | 培养基管数 | 稀释度 | 灵敏度 | ||||||||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 | ||||
| 肺炎支原体ATCC 15531 | 支原体肉汤培养基 | 1 | ||||||||||
| 2 | ||||||||||||
| 3 | ||||||||||||
| 口腔支原体ATCC 23714 | 精氨酸支原体肉汤培养基 | 1 | ||||||||||
| 2 | ||||||||||||
| 3 | ||||||||||||
| 结论：支原休肉汤培养基接种肺炎支原体ATCC 15531，其灵敏度达到 ；精氨酸支原休肉汤培养基接种口腔支原体ATCC 23714，其灵敏度达到 。 | ||||||||||||
2 中国药典2020年版三部通则3301(第一法 培养法)
2.1 供试品检查流程
2.2检验方法(培养时间27天)
(1)取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支(已冷至36℃±1℃)，每支培养基接种供试品 (0.5～1.0)mL，置 (36±1) 恒温培养箱℃培养 (21) 天。于接种后的第7天从4支原体液体培养基中各取2支进行次代培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置 (36±1) ℃培养 (21天)，每隔3天观察1次。
(2)结果判定：培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格;如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。
2.3 检验结果(注：+ 表示变色，有支原体生长;一 表示不变色，无支原体生长)
| 初代培养基结果 | |||||||||
| 培养基 | 管数 | 培养时间（天） | |||||||
| 1 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | ||
| 支原体肉汤培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 4 | |||||||||
| 精氨酸支原体肉汤培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 4 | |||||||||
| 支原体半流体培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 精氨酸支原体半流体培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 次代（初代培养7天后转接）培养结果 | |||||||||
| 培养基 | 管数 | 培养时间（天） | |||||||
| 1 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | ||
| 支原体肉汤培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 4 | |||||||||
| 支原体半流体培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 4 | |||||||||
| 精氨酸支原体肉汤培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 4 | |||||||||
| 精氨酸支原体半流体培养基 | 1 | ||||||||
| 2 | |||||||||
| 3 | |||||||||
| 4 | |||||||||
| 所测样品结果判定： □ 合格 □ 不合格 | |||||||||
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