基于短读长和长读长宏基因组的肠道病毒基因组研究进展

近年来，宏基因组组装技术在人类肠道病毒组的研究中取得了显著进展。然而，目前缺乏对不同组装工具在病毒基因组识别效率上的比较评估，尤其是在第二代测序（NGS）和第三代测序（TGS）数据上的应用。

测序数据的获取与预处理：

使用了中国人类肠道病毒组（CHGV）目录中的95个健康中国居民的粪便样本，这些样本均经过短读长和长读长测序。样本通过病毒样颗粒（VLP）富集协议处理后，提取双链DNA并分别进行Illumina HiSeq2000和PacBio RS II测序。测序数据经过Trimmomatic和pbccs软件进行预处理，去除接头和低质量碱基，并去除与人类参考基因组hg38比对的人类相关读段。

组装与病毒基因组识别：

使用12种不同的组装器对VLP测序数据进行组装，包括3种短读长组装器（IDBA-UD、MEGAHIT和metaSPAdes）、5种长读长组装器（Canu、FALCON、Hifiasm-meta、metaFlye和wtdbg2）以及4种混合组装器（IDBA-hyb、hybridSPAdes、metaViralSPAdes和OPERA-MS）。组装后的contig通过cd-hit进行去冗余处理，并使用VirSorter2、DeepVirFinder、VirFinder等病毒识别软件进行病毒contig的识别，最终将病毒contig聚类为非冗余的物种水平病毒contig，即vOTUs。

病毒基因组的分箱与质量评估：

对识别出的病毒vOTUs进行多覆盖率分箱，使用了CONCOCT、MetaBAT2、AVAMB和vRhyme四种分箱方法。使用CheckV工具对vOTUs和分箱结果的质量进行评估，包括完整性、污染程度等指标，并对高质量vOTUs进行分类注释和系统发育分析。

关键发现：

1. 在短读长、长读长和混合数据集上，MEGAHIT、metaFlye和hybridSPAdes分别表现出最佳性能，能够识别出更多、更长且质量更高的vOTUs。不同组装器之间在高质量vOTUs的识别上具有显著的互补性，联合使用多种组装器可以显著扩展高质量病毒基因组的数量。

2. 短读长和长读长数据在病毒基因组识别上具有显著差异，两者之间识别出的高质量vOTUs重叠度较低，表明数据类型对病毒基因组的恢复具有重要影响。而短读长和混合数据集之间的识别结果有较大重叠，可能是因为混合组装器在预组装阶段使用了短读长数据。

3. 四种分箱方法在病毒基因组的分箱中表现出不同的性能。AVAMB在高质量分箱的数量上表现最佳，MetaBAT2在分类注释一致性上表现最高，而vRhyme在所有评估指标上表现出较为均衡的性能。

结论：通过对95个肠道病毒样颗粒样本的短读长和长读长测序数据进行综合分析，评估了12种组装器和4种分箱方法在病毒基因组发现中的性能。研究结果表明，MEGAHIT、metaFlye和hybridSPAdes在各自的数据类型中表现出色，不同组装器和数据类型产生的vOTUs具有高度的互补性和差异性。因此，在进行肠道病毒组研究时，建议采用多种组装工具和数据类型相结合的方法，以更全面地恢复病毒基因组。此外，本研究还强调了开发专门针对肠道病毒组组装的工具的迫切需求。

参考来源：Wang H, Sun C, Li Y, et al. Complementary insights into gut viral genomes: a comparative benchmark of short-and long-read metagenomes using diverse assemblers and binners[J]. Microbiome, 2024, 12: 260.