猪圆环病毒2型（PCV2）引发的猪圆环病毒病（PCVD）是全球养猪业面临的重大挑战，可导致断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）等疾病，造成显著经济损失。近日，浙江大学与浙江海正动物保健品有限公司的联合研究团队，在PCV2关键抗原Cap蛋白的高产技术上取得重要进展，相关成果为优化疫苗生产工艺、降低成本提供了关键数据。

Cap蛋白是PCV2的主要保护性抗原，可在昆虫杆状病毒表达系统中自组装为病毒样颗粒（VLPs），是疫苗生产的核心原料。研究团队聚焦两种主流商业化杆状病毒构建系统——Bac-to-Bac和flashBAC，通过对比发现了显著差异。

图 1 Bac-to-Bac和flashBAC构建的示意图

如图1所示，两种系统的构建流程存在本质区别：Bac-to-Bac系统需先将目的基因克隆到载体，再转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经转座生成重组杆粒，最后转染昆虫细胞获得病毒；而flashBAC系统通过兼容转移载体与线性化杆粒共转染昆虫细胞，在细胞内通过同源重组直接生成重组病毒，步骤更简洁。

而实验结果显示，无论在Sf9还是High Five细胞中，flashBAC系统的Cap蛋白表达量均显著高于Bac-to-Bac系统。这与flashBAC Gold载体的基因优化密切相关——该载体删除了可能导致蛋白降解的chiA和v-cath基因，延长了有效表达时间。

图 2 杆状病毒感染后Sf9和High Five细胞的生长参数

在细胞类型选择上，研究对比了Sf9和High Five细胞的表现。图2显示，两种细胞感染病毒后的生长趋势相似（viable细胞数均在1-2天上升后下降，活力在第5天降至20%左右），但High Five细胞的Cap蛋白表达能力更优。

图 3 pFast-Cap、pBAC-1-Cap和pBAC-4×Cap载体的构建

进一步研究发现，增加Cap基因拷贝数可提升表达量。团队构建了单拷贝（pBAC-1-Cap）和四拷贝（pBAC-4×Cap）载体（图3展示了载体构建的酶切与PCR验证结果），发现四拷贝载体在High Five细胞中表现最佳：感染后5天（27℃培养）的蛋白产量达432μg/mL，远超文献报道的最高200μg/mL水平。不过，产量提升并非线性，四拷贝较单拷贝仅增加12%，推测与细胞表达容量限制或负反馈机制有关。

图 4 使用阳离子交换色谱法纯化Cap蛋白

通过阳离子交换层析纯化后（图4显示，经离心、过滤和层析步骤，可获得高纯度Cap蛋白，Western blot验证其特异性），团队对蛋白的免疫原性进行了评估。

动物实验结果显示：小鼠免疫5周后，Cap特异性抗体效价峰值达1:12,800；猪免疫后4-7周抗体效价逐步升高，证明该蛋白能有效诱导动物产生免疫应答，具备作为疫苗抗原的潜力。

目前商业化PCV2疫苗（如Ingelvac CircoFLEX®）均依赖杆状病毒-昆虫细胞系统生产。本研究明确了“flashBAC系统+High Five细胞+四拷贝基因”的最优组合，不仅将Cap蛋白产量提升至新高度，还为简化生产流程、降低成本提供了可行方案。未来，通过优化感染复数（MOI）、启动子工程等因素，有望进一步提升生产效率，助力猪圆环病毒疫苗的工业化升级。

原文链接：https://doi.org/10.3390/vaccines13080801