研究背景

家禽传染性支气管炎（IB）是由IBV引起的一种急性、高度传染性疾病，给全球家禽业带来了严重的经济负担。IBV具有广泛的血清型多样性和有限的交叉保护性，使得传统疫苗难以提供足够的保护。尽管已有商业佐剂用于增强疫苗效力，但它们在诱导全面免疫反应方面存在局限性。外泌体作为一种新型的免疫调节剂，因其具有靶向性、精准递送能力和免疫刺激效果，成为了疫苗佐剂研究的热点。本研究首次系统评估了HD11M1-exo作为IBV疫苗佐剂的潜力，涵盖了体外、胚胎蛋和体内模型。

研究方法

外泌体的分离与鉴定：利用超速离心法从LPS激活的HD11巨噬细胞培养上清中分离HD11M1-exo，并通过透射电子显微镜、粒径分析和西方印迹实验对其进行表征。

体外细胞实验：将HD11细胞分为对照组和外泌体处理组，检测外泌体对巨噬细胞吞噬能力的影响以及LPS/TLR4信号通路相关基因和蛋白的表达水平。

鸡胚实验：将18日龄鸡胚分为四组，分别进行PBS、HD11M1-exo、IBV和HD11M1-exo+IBV处理，观察胚胎临床症状、病理变化，并检测气管细胞因子水平。

动物实验：通过眼滴和鼻滴方式对1日龄雏鸡进行免疫，分为不同处理组，监测鸡的临床状态，并在不同时间点收集泪液和组织样本，检测免疫指标。

免疫与保护效果评估：对不同免疫组的鸡进行IBV挑战，评估病毒载量、体重、病理变化等指标。

研究结果

外泌体成功分离与鉴定：为了确定巨噬细胞在脂多糖(LPS)刺激后是否极化为M1型，使用qPCR检测了刺激组（LPS组）和对照组（NC组）巨噬细胞中典型的M1型标记物在刺激24小时后的表达水平。结果表明，与NC组相比，LPS组的iNOS、IL-6、IL-12、IL-23、CD80和CD86的表达水平显著升高（P<0.05）（图1A），通过透射电子显微镜和西方印迹实验，研究者确认了HD11M1-exo的典型外泌体特征，表明分离过程成功且外泌体具有良好的纯度和完整性。HD11M1-exo具有典型的外泌体结构（图1C），粒径主要分布在30-200nm之间（图1B），且检测到外泌体标志物HSP70和ALIX（图1D）。 

体外免疫激活效果显著：HD11M1-exo显著增强巨噬细胞的吞噬能力（图2A）。LPS/TLR4信号通路的关键基因（如CD14、TLR4、TRAM、TRAF3、IRF3、CD80）和蛋白（如TLR4、IRF3、CD80）表达水平显著上调（图2C）。这一结果表明，HD11M1-exo能够通过激活LPS/TLR4信号通路显著增强巨噬细胞的免疫活性（图2D），为后续的体内实验奠定了基础。

鸡胚抗病毒能力提升：在鸡胚模型中（图4A），HD11M1-exo预处理显著上调气管中多种细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、TLR4、IFN-γ）的表达（图4B）。预处理组的鸡胚在IBV感染后表现出更少的病理损伤。这表明HD11M1-exo能够显著增强鸡胚的抗病毒能力，减轻IBV感染引起的病理损伤，显示出其作为免疫调节剂的潜力。

体内免疫增强作用明显：在体内实验中，HD11M1-exo处理的鸡在呼吸道组织中CD80和CD86的表达显著上调（图6）。TGF-β4和IgA水平显著升高，表明外泌体能增强细胞免疫和黏膜免疫反应。这一结果进一步证实了HD11M1-exo在体内环境中能够显著增强细胞免疫和黏膜免疫反应，为疫苗佐剂的应用提供了有力支持。

疫苗佐剂效果卓越：HD11M1-exo与H120疫苗联合使用显著提高了疫苗诱导的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫反应（图11A-B）。在IBV挑战后，联合使用组的病毒载量显著降低，病理损伤减轻。 这一结果表明，HD11M1-exo作为疫苗佐剂能够显著增强疫苗的保护效力，为家禽IBV疫苗的研发提供了新的方向。

研究与展望

家禽业正面临着多种疾病的威胁，如禽流感和新城疫（又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟）等，这些疾病不仅影响家禽的健康和生产性能，还可能对公共卫生构成威胁。因此，开发新型、高效的疫苗和免疫调节剂显得尤为重要。这项研究为家禽IBV疫苗的研发提供了新的方向，即利用外泌体作为佐剂来增强疫苗的免疫原性和保护效力。这不仅有助于解决IBV的防控难题，为家禽疫苗的创新提供了有力支持，有望推动家禽业的可持续发展，并为保障食品安全和公共卫生做出贡献，还可能对其他家禽呼吸道疾病的疫苗研发产生积极影响。然而，尽管研究取得了令人鼓舞的结果，但在实际应用中仍面临一些挑战，如外泌体的大规模生产和质量控制、长期稳定性和安全性等问题。未来的研究需要进一步优化外泌体的制备工艺，探索其在不同家禽疾病模型中的应用潜力，并进行更广泛的临床试验，以确保其在实际养殖环境中的有效性和安全性。

参考文献链接：https://doi.org/10.1128/jvi.01156-25