中文题目：通过表面活性剂释放和两步磁珠提取纯化有效浓缩废水中的病毒核酸

期刊及年份：Science of The Total Environment 2024

通讯作者：危宏平，中科院武汉病毒所研究员，武汉国家生物安全（三级）实验室主任。研究方向：微生物快速检测方法；抗耐药细菌的裂解酶与噬菌体治疗；细菌外膜瀼泡疫苗与噬菌体载体疫苗。

https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2024.175742

摘要：基于废水的流行病学（WBE）是临床监测的重要补充，能够有效监控人群中的病毒感染情况，并跟踪社区中各种传染性病原体的存在及其流行病学动态。然而，废水中的病毒载量通常较低，现有的用于废水流行病学的病毒浓缩方法劳动强度大、耗时长且回收效率低。为了解决这些问题，我们开发了一种基于磁珠的半自动化方法，包括提取和纯化步骤，能够在55分钟内直接从污水中浓缩病毒核酸。在浓缩之前，使用0.5%的LDS对废水进行预处理，以灭活病毒并从液相和固相中释放病毒核酸，从而提高回收率。在优化条件下，结合逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）的浓缩方法可以在2.5小时内检测到废水中外源添加的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA，最低可达4.9拷贝/毫升，平均回收率超过80%。对实际污水的测试证明了该方法适用于检测不同污水中的多种病毒。此外，通过多重扩增子测序在两个样本中成功鉴定出SARS-CoV-2的变种。总之，该新方法为在各种污水中进行病原病毒的废水流行病学提供了一种更加高效的途径。

主要内容

感染者的病毒和核酸可以通过排泄物进入废水系统。因此，废水监测（WBE）成为追踪社区内病毒传播的有效工具，能够帮助相关部门了解病毒的动态而不影响日常生活。WBE不仅补充现有的传染病监测系统，还可以作为传染病爆发的早期预警机制。目前，它已被用于监测多种病毒，包括SARS-CoV-2等，尤其是通过扩增子测序和RT-qPCR检测病毒变异株。然而，废水中病毒浓度极低，传统的病毒检测方法存在多个问题，包括耗时长、回收率低（0.08%到66%）、处理步骤复杂以及设备昂贵。主要挑战还包括病毒核酸的降解、固相中病毒的丢弃和PCR抑制剂的存在。研究团队开发了一种基于磁珠的半自动化高灵敏度方法，通过加入表面活性剂来释放废水中的病毒核酸，并在去除PCR抑制剂的同时浓缩病毒核酸。实验结果显示，该方法对医院和城市污水中的SARS-CoV-2等病毒检测具有很高的效率和应用潜力。该方法不仅能快速高效地检测废水中的病毒（如新冠病毒），还能够识别病毒变异株，在实际应用中具有广阔的前景。

表面活性剂提高废水中病毒核酸的回收率

废水成分复杂，含有固体颗粒等多种物质，导致提取和浓缩核酸面临挑战。未经处理的废水中，磁珠易于聚集，且病毒可能存在于废水的液相和固相中。因此，废水的预处理对于确保生物安全和成功浓缩病毒或病毒核酸至关重要。为促进后续磁珠提取核酸的步骤，首先使用0.45 μm孔径的PES膜过滤废水，去除大部分固体、细菌和真菌。然而，过滤过程中病毒颗粒或核酸吸附到膜上，会导致回收率降低。此外，固相中结合的病毒颗粒和核酸也会在过滤过程中被去除，进一步降低回收率。众所周知，表面活性剂可以与病毒的脂质膜、蛋白质或两者相互作用，暴露病毒核酸并失去感染能力。为了减少上述问题，测试了表面活性剂的效果。

Fig. 2. Evaluation of surfactants application in wastewater pretreatment. (A) Surfactant-assisted viral nucleic acids recovery in wastewater filtration. The final concentrations of Tween 20, SLS or LDS in wastewater were 0.1 %, 0.5 % and 1 %. DEPC-F or DEPC-NF indicates whether the virus solution diluted with DEPC-treated water was filtered through the PES membrane or not. (B) and (C) Release of various viral nucleic acids with the assistance of 0.5 % LDS, and comparison of Ct values of viral RNA in the liquid fraction, the solid fraction and their mixture. (D) and (E) Comparison of SARS-CoV-2 RNA concentrations of the liquid fraction, solid fraction, and their mixture. (F) A typical Microscopy image of the cells after 72 h incubation with virus treated with LDS. (G) A typical microscopy image of the CPE after 72 h incubation with virus treated with 2 % FBS DMEM (positive controls). Results are shown as means ± SD (n = 3). “&” represents two of the three repeats showing no amplification while “#” indicates one of the three repeats showing no amplification.

首先，使用DEPC处理的水添加灭活的SARS-CoV-2测试过滤器对病毒颗粒和核酸的吸附作用。与只用DEPC处理的对照组相比，经过过滤的组的Ct值显著增加，表明大多数病毒核酸在过滤过程中丢失了。加入表面活性剂（Tween 20、SLS或LDS）可以减少这种损失，经过LDS处理的样品与对照组的Ct值差异不显著（p > 0.05）。其次，使用医院采集的两个实际污水样品测试表面活性剂释放病毒核酸的能力。将样品离心以分离液相和固相，并加入0.5%的LDS溶液。结果显示，直接用0.5%LDS处理的样品在检测SARS-CoV-2、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和辣椒轻斑驳病毒时的Ct值最低，表明液相和固相中的病毒核酸回收效果不同。此外，LDS可以释放固相中的病毒核酸。

第三，考虑到生物安全性，测试了表面活性剂对SARS-CoV-2的灭活效果。结果表明，即使在最低浓度（0.05%）的LDS处理2分钟后，SARS-CoV-2的活性显著下降，病毒感染能力丧失，细胞保持活力，而未处理的样品则在72小时孵育后表现出明显的细胞病变效应。

小结：1. LDS的效果显著：LDS能够有效帮助回收废水中的病毒核酸，尤其是在0.5%浓度时，其表现优于其他表面活性剂（如Tween 20、SLS）。2. 固相和液相中病毒核酸的分布：不同废水样品中的病毒核酸在固相和液相中的分布不同，但结合两者的混合物可以最大化病毒检测效果。3. 病毒灭活：LDS处理病毒后能够有效灭活其感染能力，保证生物安全性。

磁珠提取和纯化的两步法的开发

Fig. 3. Optimization of the two-step magnetic bead extraction and purification. (A) Optimization of the amounts of the magnetic beads used for extraction of SARS-CoV-2 nucleic acid in 10 mL wastewater. (B) Optimization of the lysis temperature during the first extraction step. (C) Optimization of the elution temperature during the first extraction step. (D) Optimization of the volume ratio of the magnetic beads to the 400 μL eluate from the first extraction step in the second purification step. Results shown are means ± SD (n = 3).

WBE（基于废水的流行病学）分析面临的挑战包括病毒核酸提取效率低以及复杂的基质对qPCR的抑制。我们在核酸提取步骤的基础上，增加了使用不同分子修饰的磁珠进行核酸纯化，以吸附核酸，确保最终获得的核酸不含抑制剂，并进一步降低洗脱体积以达到更高的浓缩效果。首先，提取步骤中的三个重要因素——磁珠用量、裂解和洗脱过程中的温度——进行了优化。在提取加入10,000拷贝/mL灭活SARS-CoV-2的阴性废水样品时，随着磁珠用量的增加，SARS-CoV-2核酸的回收率也提高，使用1600 μg磁珠的回收率几乎达到100%。随后，优化了裂解步骤的温度为50°C，洗脱温度为60°C。优化后的两步提取和纯化方法使用羧基修饰的磁珠，移除了提取后可能残留的PCR抑制剂，最佳核酸回收效果在磁珠与洗脱液体积比为1.2或更高时实现，1.8倍体积适用于复杂废水样品。

小结：使用800 μg磁珠能够显著提高核酸回收率，接近100%。50°C是裂解病毒核酸的最佳温度，能够实现较高的回收效率。60°C是洗脱病毒核酸的最佳温度。磁珠与洗脱液体积比为1.2或1.8时都能达到最佳回收效率，二者之间无显著差异。

方法的回收效率和灵敏度

Fig. 4. Evaluation of the recovery efficiency and sensitivity of the developed method. (A) The recovery efficiency of the viral RNA in wastewater at three different concentrations. Results shown are means ± SD (n = 6). (B) The probit curve reflects observations from 8 replicates at each dilution. The limit of detection (LOD) was the value corresponding to a probability of 0.95.

SARS-CoV-2 RNA的回收效率通过分析三组废水样品来评估，样品中加入了不同浓度的灭活SARS-CoV-2。结果表明，回收效率分别为91.22% ± 3.53%、91.36% ± 4.69%和88.38% ± 7.55%。为了确定该方法的灵敏度，进行了8次重复的稀释实验，基于剂量反应曲线计算出检测限（LOD）为4.9拷贝/mL。

小结：在不同浓度下，该方法回收效率均在90%左右，表明该方法对不同浓度的病毒核酸都能高效回收。检测限为 4.9 copies/mL，显示该方法对SARS-CoV-2 RNA的高灵敏度检测能力，适合低浓度病毒检测。

与PEG/NaCl沉淀法的病毒RNA回收率比较

Fig. 5. Comparison of our method and PEG/NaCl precipitation to detect viruses in two sewage samples with different turbidity. (A) Image of the two wastewater samples with different turbidity. (B) Ct values of the viruses concentrated by the two methods for sample 1. (C) Ct values of the viruses concentrated by the two methods for sample 2. Results shown are means ± SD (n = 3). “&” represents that two of the three repeats give no amplification while the blue dashed box represents that all three repeats give no amplification by the RT-PCR assay.

小结：1. 相比PEG/NaCl沉淀法，本研究方法在不同病毒的浓缩和检测中表现出更低的Ct值，这表明其具有更高的检测灵敏度和效率，尤其是在SARS-CoV-2、流感病毒和其他病毒的检测中。2. 尽管样本1和样本2的浊度不同，本研究方法在两种样本中都表现出显著的优势，特别是在样本1（高浊度样本）中，本方法仍然能够实现较高的病毒核酸回收率。3. RSVA病毒在两种方法中均显示出较难检测的特性，这表明不同病毒在废水中的检测难度可能有所不同。

SARS-CoV-2 RNA的WBE分析

Fig. 6. WBE analysis of wastewater samples from two hospitals in Wuhan, China. (A) and (B) Comparison of SARS-CoV-2 RNA levels in the sewages with SARS-CoV-2 positive cases of weekly new hospital admissions in hospital 1 (Hos1) and hospital 2 (Hos2). Simple linear regression between the logarithm of the 2-week moving average of SARS-CoV-2 RNA concentration and the weekly positive hospitalized patients in Hos1 (C) and Hos2 (D).

为了测试该方法在不同来源废水中的应用，我们在2023年6月底从江西萍乡和湖北武汉的多个地方收集了废水样本，并进行了SARS-CoV-2感染率分析。在87个样本中，56个样本SARS-CoV-2 N基因检测为阳性，阳性率为64.37%。从武汉的医院采集的废水样本中，所有样本均检测为SARS-CoV-2阳性，并且病毒核酸浓度趋势与医院新入院患者数量大致相同，提前约2周。此外，在2023年7月初和月底对两个高Ct值（Ct = 29–30）的废水样本进行了扩增子测序，结果显示样本中的SARS-CoV-2变异株分别属于Pango谱系FY.3.2和FL.24，数据已存储在国家基因组数据中心。

小结：1. 废水中的SARS-CoV-2 RNA浓度与住院病例数有显著相关性：废水中的RNA浓度可以反映医院中COVID-19患者的住院人数，且通常比住院病例的增长早几天。这意味着通过废水监测，能够提前预测疫情的发展趋势。2. 废水监测作为预警工具：由于废水中的病毒水平在住院病例数增加之前出现增长，因此废水监测可以作为社区中感染情况的早期预警工具，帮助公共卫生部门及时采取应对措施。3. 线性回归分析支持相关性：线性回归分析显示废水中SARS-CoV-2 RNA浓度与每周新增住院病例数之间存在显著正相关性，特别是在医院1中，相关性更强。

全文总结

1.方法开发：本研究开发了一种新的快速方法，能够从污水中浓缩病毒核酸，利用表面活性剂释放病毒核酸，并通过两步磁珠提取和纯化实现了更高效的病毒检测。

2.灵敏度与效率：该方法可以检测到污水中每毫升4.9个拷贝的SARS-CoV-2 RNA，回收率超过80%，比传统的PEG/NaCl沉淀法效率更高。

3.适应性：该方法适用于不同类型的污水样品，能够提取污水中的液相和固相部分的病毒核酸，因此可以更准确地比较不同污水样品中的病毒含量。

4.自动化与高效：该方法使用磁珠提取和纯化，具有很高的自动化潜力，能够在短时间内处理多个污水样本，大大提高了操作效率，减少了人力成本。

5.广泛应用：该方法不仅能够检测SARS-CoV-2，还可以用于检测污水中的其他病毒，进一步的靶向测序技术可以帮助检测低丰度的病毒变异株。

6.未来前景：未来可以通过开发全自动化的核酸提取设备，进一步提高该方法的速度和效率，促进其在基于废水的流行病学监测中的应用。