双重或多重细菌感染日益频繁，但目前治疗方法有限，因为需要复杂的策略来应对不同的疾病机制。合成生物学的发展为利用工程益生菌解决这一问题提供了可能。通过设计具有特定功能的基因回路，益生菌可以实现对多种病原体的检测和靶向治疗，从而提供一种新颖的双重感染防治方法。近日，山东大学王倩、祁庆生团队在Gut Microbes上发表了题为“Minimal Logic Gates for Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 Sensing and Treatment of Dual-Bacteria Intestinal Infection”的文章，研究了合成益生菌治疗肠道双重病原菌感染的重要进展。该研究基于AND逻辑门原理，在益生菌大肠杆菌Nissle 1917中构建了精简的双信号响应系统，使其能特异性识别铜绿假单胞菌和小肠结肠炎耶尔森菌共存时的群体感应信号分子（C12-AHL/C6-AHL），并通过优化人工启动子设计实现高效双信号协同激活。进一步，在工程菌中整合趋化与杀伤基因线路，使之在体外展现出对两种病原体的定向趋化与精准杀菌能力，并在双菌感染的小鼠模型中实现显著的预防和治疗效果，表现为体重恢复、结肠长度缩短程度减轻、炎症因子水平降低、致病菌被大量清除并重建菌群稳态。该研究首创“感知-诊疗”一体化的智能益生菌系统，为复杂肠道感染提供了治疗新范式。

主要研究结果

该研究首先构建了两套独立的基因回路以实现对两种病原体的特异性检测与杀伤。针对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和小肠结肠炎耶尔森菌（Y. enterocolitica）分泌的群体感应信号分子C12-AHL和C6-AHL，分别设计了LasR-BFP和EsaR-mCherry传感系统，通过荧光蛋白表达强度动态响应信号分子浓度（0-5000 nM范围内线性递增，最大荧光强度分别达980 AU和800 AU），且两系统无交叉反应。将荧光基因替换为抗菌肽Micromycin S（McsS）后，构建的EcN-KillP和EcN-KillY菌株在体外实验中展现出显著的病原体杀伤能力，可使对应病原体的OD600值显著下降，并形成清晰抑菌圈。

为实现对双菌感染的精准响应，研究设计了最小化AND逻辑门系统。通过在LasR激活的Plas启动子-35/-10区插入EsaR阻遏蛋白结合位点，构建合成启动子Pl&e，仅在C12和C6双信号同时存在时启动下游基因表达。进一步通过在启动子上游-83.5位置插入CRP结合位点优化系统，使LEc-GFP-83.5的动态范围提升10倍（最大荧光强度达11000 AU），且无基础泄漏。正交实验验证显示，该逻辑门仅对双信号组合产生特异性响应，单信号或无关信号均不激活，与双病原体共培养时荧光强度显著升高。

工程化EcN通过趋化-杀伤协同系统增强治疗效能。敲除cheZ和motA基因构建趋化缺陷株后，引入含降解标签的CheZ-YbaQ模块，使菌株在双信号浓度梯度下通过CheZ调控鞭毛运动实现定向趋化。将AND逻辑门与McsS杀伤模块、E7裂解蛋白偶联构建的EcN-KillD菌株，在双病原体存在时可分泌McsS并通过自裂解释放抗菌肽，体外共培养使混合菌OD600值降至0.8-0.9，平板抑菌圈直径达2.2 cm。趋化-杀伤协同系统（EcN-Motility-Kill）可沿信号梯度定向移动并高效清除病原体。

在小鼠模型中，工程化EcN展现出显著的预防和治疗效果。双菌感染模型中小鼠出现体重下降（第4天达最低值）、结肠缩短（平均4 cm，p<0.0001）及IL-6/IL-1β炎症因子高表达（远端结肠IL-1β升高5倍）。EcN-KillP和EcN-KillY分别降低单菌感染小鼠的炎症因子水平（IL-6和IL-1β仅为对照组2倍），体重和结肠长度恢复优于野生型EcN。EcN-KillD干预双菌感染小鼠后，体重显著恢复，结肠长度增至5.4 cm（p<0.0005），肠道内P. aeruginosa和Y. enterocolitica比例分别从22%和21%降至12%和10%，独特菌群比例从9%升至38%，实现了病原体清除与肠道菌群稳态修复的双重效果。总而言之，该研究成功设计了最小逻辑门工程化EcN，通过特异性传感、双信号AND逻辑响应、定向趋化与协同杀伤，实现了对P. aeruginosa和Y. enterocolitica双菌感染的高效检测与治疗，为多菌感染的益生菌疗法提供了新策略。

 参考文献：Li H, Zhang S, Yin J, Wang G, Wang Q, Xia Y, Li L, Qi Q, Wang Q. Minimal logic gates for probiotic Escherichia coli Nissle 1917 sensing and treatment of dual-bacteria intestinal infection. Gut Microbes. 2025 Dec;17(1):2530156. doi: 10.1080/19490976.2025.2530156. Epub 2025 Jul 6. PMID: 40619672; PMCID: PMC12239797.