揭开地下水中未知的病毒世界

中文题目: 揭开地下水中未知的病毒世界

期刊及年份：Nature Communications，2024年8月

https://doi.org/10.1038/s41467-024-51230-y

通讯作者：倪晋仁，中国科学院院士，北京大学教授。主要从事水沙两相流理论及其在水环境、河流动力地貌领域的拓展研究，同时开展水体污染控制理论与治理技术方面的探索。

摘要：病毒作为主要的生物实体，在地下领域知之甚少。在此，我们建立了首个地下水病毒宏基因组目录(GWVC)，其中包括从中国7个地质环境区的607口监测井中检测到的280,420种(≥5 kb)病毒。在将全球已知地下水病毒组合扩大约10倍的过程中，我们发现了超过99%的新病毒和约95%的新病毒簇。通过将病毒与119个原核生物门的宿主联系起来，我们将地下水中已知被病毒感染的微生物门的数量增加了一倍。CPR细菌和DPANN古细菌是含水层中重要的超小型共生体，对毒力病毒易感。某些完整的CPR病毒甚至可能感染非CPR细菌，而部分CPR/DPANN病毒携带细胞表面修饰基因，帮助共生体细胞粘附于自由生活的微生物。本研究揭示了地下水中未知的病毒世界和与甲烷、氮、硫和磷循环相关的辅助代谢，并强调了地下病毒圈-病毒生态学中的重要性。  

主要内容：

GWVC极大地扩展了地下水病毒圈

通过挖掘来自中国7个地质环境区(东北平原山地、黄淮海及长江三角洲平原、华南基岩低山麓、西北黄土高原、西南喀斯特岩山、西北干旱沙漠、和青藏高原高寒冻土)的607份监测井样本的宏基因组数据。构建了地下水病毒目录(GWVC)。采用四种病毒鉴定方法和质量控制(方法)，鉴定出312,741个病毒contigs(≥5kb)，并以95%的平均核苷酸同源性(ANI)聚类。生成的GWVC由280,420个非冗余病毒contigs(≥5 kb)组成，代表了大约物种水平的votu。GWVC中votu的完整性水平从短片段到完整或接近完整的基因组不等，包括5366个完整基因组、6092个高质量基因组和15669个中等质量基因组(图1b)。GWVC的病毒基因组大小从5 kb到543.1 kb不等，长度≥10 kb的vOTUs共有107610个。完整基因组的平均大小最大（49.0 kb），其次是高质量（41.2 kb）、中等质量（36.1 kb）、低质量（11.0 kb）和未确定（8.3 kb）。在本研究中来自GWVC和IMG/VR（地下水剖面）的14,578个完整或高质量基因组中 GWVC贡献了超过78.6%（11,458个基因组）的未培养病毒。为了探索GWVC的新颖性，从GWVC和IMG/VR（地下水、海洋、人类、地表淡水、陆地和废水）中提取病毒组（≥10 kb）及其蛋白质进行比较分析（方法）。vOTUs和蛋白簇(PCs)水平的GWVC使已知地下水病毒种类的数量增加了10倍，PCs增加了8倍。值得注意的是，绝大多数的vOTUs/PCs（vOTUs: 99.8%, PCs: 86.3%）是GWVC所特有的，这表明含水层具有作为未知病毒大型储存库的巨大潜力。

图1.地下水病毒组目录（GWVC）汇编。(A) GWVC中votu的地理分布。三角形大小表示在每个采样点确定的votu数量。用不同的颜色区分了7个地质环境带。(B) GWVC中votu的完整性和长度(≥5kb)。对于每个箱线图，中线和须表示中位数和四分位数范围的1.5倍。方框的上下两侧表示第25和第75个百分位数之间的四分位数范围。胡须以外的点是潜在的异常值。(C) GWVC、IMG/ VR(地下水段)中votu(≥10kb)及其PCs数量，由两个数据库共享。(D)基于与整个IMG/VR比较的votu(≥10kb)及其PCs的新颖性。蓝色和灰色的条形图分别表示新的和已知的votu / PCs的比例。(E)GWVC中votu(≥10kb)的分类注释。条形图显示了未注释(红色)和注释(灰色)的votu / pc的比例。Sankey图显示病毒分类注释。

病毒感染的范围非常广泛

为了研究地下水中病毒与宿主的相互作用，本研究从607个宏基因组中重建了34,993个完整性>70%、污染<10%的原核宏基因组组装基因组(MAGs)(方法)。在本研究中，我们使用四种计算方法鉴定了193,952个病毒-宿主连接，得到71,600个vOTUs (25.5%)与21,634个从地下水宏基因组重建的原核MAGs相连。在门水平上，预计病毒将感染104个细菌门和15个古细菌门。地下水生态系统中被病毒感染的宿主门数量是其他生态系统(如陆地、海洋、地表淡水、人类和废水)的两倍多，这意味着地下水是病毒-宿主相互作用的一个未被充分开发的热点。研究发现，地下水微生物群中vOTUs最多(n = 41177)与变形菌门相关，其次是Patescibacteria门(CPR bacteria,n= 4338)、拟杆菌门(n = 3868)、放线菌门(n = 2836)和脱硫菌门(n = 2703)。古细菌也被预测为2510个vOTUs的宿主，包括热变形菌门(n = 1083)、纳米古细菌门(n = 681)、盐杆菌门(n = 278)、Aenigmatarchaeota (n = 173)和Hadarchaeota (n = 79)。

CPR细菌和DPANN古细菌是原核生物生命树中两个重要的类群，它们通常具有一些保守的特征，如超小的细胞大小和极低的基因组。值得注意的是，CPR和DPANN微生物缺乏完整的生物合成途径来合成氨基酸和核苷酸。因此，它们通常作为其他自由生活的原核生物的共生体生活，以获得必需的生物分子，这些共生体的小细胞可以通过各种细胞表面修饰（例如，菌毛、糖基转移酶、刀豆蛋白和LamG蛋白）附着在其他微生物的大细胞上。此外，在CPR细菌和DPANN古细菌中也发现了限制性修饰和CRISPR-Cas等抗病毒系统，这表明这些共生体中存在丰富的病毒群。尽管最近的一项研究报道了一些被Altiarchaeota的CRISPR间隔物靶向的含水层病毒，但地下水生态系统中的CPR/DPANN病毒在很大程度上仍然未知，特别是在多样性、生活方式、功能潜力及其在微生物共生中的作用方面。在这些CPR/ DPANN谱系中，Paceibacteria (CPR)和Nanoarchaeota (DPANN)是地下水病毒的重要宿主，而Saccharimonadia (CPR)和Altiarchaeota (DPANN)分别是哺乳动物消化道中和深陆地地下病毒的主要宿主。  

为了探索病毒在微生物介导的生物地球化学循环中的潜在作用，我们注释了宿主MAGs在甲烷、氮和硫代谢中的功能电位。我们发现许多病毒(n = 49,184, 68.7%的宿主连接vOTUs)与参与甲烷、氮和硫代谢的原核宿主相连，这表明病毒捕食对微生物介导的生物地球化学循环有潜在影响。病毒与宿主之间的联系表明，地下水环境中涉及典型甲烷、氮和硫循环的几乎所有微生物代谢过程都可能受到病毒感染的影响，特别是(1)细菌甲烷氧化和古细菌甲烷生成；(2)细菌/古细菌异化硝酸盐还原、反硝化和固氮作用；(3)细菌/古细菌歧化硫酸盐还原、硫酸盐歧化和同化硫酸盐还原。一方面，病毒能够在感染期间对宿主细胞进行重新编程，从而改变关键生物地球化学循环贡献者的代谢。另一方面，病毒捕食可以介导丰富的生物地球化学循环微生物的周转，并通过病毒分流加强地下水中的元素循环。在未来，将病毒影响整合到生物地球化学模型中可能有助于更好地预测地下水中的元素循环。  

为了研究病毒对地下水微生物生态的潜在影响，基于病毒-宿主丰度模式评估了不同谱系的病毒感染动态。原核病毒的组成与宿主高度偶联(图S9a)，病毒与宿主丰度之间的Spearman相关性(p <10－5,R =0.90)证实了这一点(图S9b)。谱系特异性病毒-宿主丰度比揭示了不同分类群中病毒-宿主丰度比的范围(图S9c)。对于几乎所有的谱系，包括CPR/DPANN微生物，病毒丰度经常超过宿主丰度，这表明微生物共生体可能像自由生活的微生物一样经历活跃的病毒增殖。此外，通过预测烈性/温和病毒感染不同宿主，揭示了地下水中病毒生活方式与宿主的关系(方法)。在CPR和DPANN病毒中，烈性生活方式的比例分别是温和生活方式的3.6倍和4.5倍，而在Proteobacteria和其他宿主病毒中，这一比例分别为0.62倍和0.87倍。在检测到烈性或温和病毒的样本中，与CPR/DPANN相关的病毒比与变形菌门和其他微生物相关的病毒具有更高的强毒生活方式丰度，这意味着前者更喜欢烈性的生活方式，而后者则受温和生活方式的影响。感染CPR/DPANN共生体的病毒主要是强毒病毒，它们可能通过裂解杀死宿主细胞，从而驱动地下水中CPR/DPANN群落的更新和养分循环。相比之下，感染自由微生物(如变形杆菌)的病毒主要是温和病毒，它们可以通过溶原性利用宿主，而不是杀死宿主，除非触发诱导事件。

图2. GWVC中病毒的宿主分配。(A)细菌(紫色)和古细菌(绿色)宿主的系统发育。连接到每个门的votu数量由宿主名旁边的数字表示。与大多数病毒相关的变形菌门以红色突出显示。(B)被GWVC和IMG/VR病毒感染的宿主门数。(C) 完整病毒或高质量病毒感染CPR细菌、DPANN古生菌、变形菌和其他原核生物的生活方式(烈性或温和)比例。黄色和青色条分别表示烈性和温和型votu的比例。(D)密度图显示在检测到烈性病毒或温和病毒的样本中，感染不同宿主的烈性病毒的丰度比例。虚线表示烈性病毒的平均丰度比例。

CPR/DPANN病毒调节含水层中的微生物共生关系  

通过构建地下水CPR/DPANN病毒的综合数据集，研究了CPR/DPANN病毒及其对含水层共生关系的潜在影响(方法)。使用基于CRISPR和原病毒的方法共鉴定了230种CPR病毒和23种DPANN病毒，其中超过25%的关联也可以使用其他宿主预测方法(即核苷酸序列同源性或k-mer频率匹配)发现，尽管CRISPR-Cas系统在CPR细菌中并不像在其他元和生物谱系中那样普遍，但研究人员发现了病毒与CPR CRISPR- cas系统之间存在关联的证据。例如，完整或高质量病毒基因组的原间隔序列与CPR谱系(如Paceibacteria, Gracilibacteria和Dojkabacteria)的完整CRISPR-Cas系统中的间隔序列相匹配。对于CPR-原噬菌体的关联，基于对原噬菌体的预测，在CPR谱系(如Paceibacteria, ABY1和Gracilibacteria)中发现了明显的病毒基因组整合。完整的CPR病毒基因组(n = 7)长度为36-55 kb(平均39 kb)，两个完整的DPANN病毒基因组长度均为41 kb。这表明CPR/DPANN病毒比感染其他类群的病毒具有相对较小的基因组，似乎CPR/DPANN本身与其他类群相比包含非常紧凑的基因组。在病毒基因共享网络中，CPR病毒簇密切相关，并且几个单个模块包含与不同谱系相关的病毒(例如Paceibacteria、Dojkabacteria、Microgenomatia、ABY1和JAEDAM01)，这意味着感染CPR细菌的病毒在基因组成方面可能相似。

考虑到CPR/DPANN与其他自由生活微生物的共生关系，我们随后验证了CPR/DPANN病毒在菌间感染的可能性。预计7 CPR病毒会感染非CPR门，但没有DPANN病毒与非DPANN门相关。在这些共同靶向的CPR病毒中，来自细叶杆菌噬菌体完整环状基因组的三个原间隔序列与细叶杆菌和细菌科的间隔序列相匹配。三个匹配的间隔序列在三个重复数不同的CRISPR-Cas系统中与Cas基因聚集。重要的是，Gracilibacteria噬菌体可能能够利用兼容的遗传密码机制(代码11和25)在Gracilibacteria(代码25)和Bacteriota(代码11)中复制。来自另一个与编码11兼容的圆形纤毛虫噬菌体基因组的原间隔序列与来自细菌门的间隔序列匹配，而来自变形细菌门和细菌门的间隔序列与线状纤毛虫噬菌体基因组匹配。事实上，没有分离出感染CPR细菌的病毒，主要是由于这些厌氧共生体繁殖的固有困难。然而，预测结果表明，各种实验室可培养的细菌基因组与细叶杆菌噬菌体相关，这意味着在可培养的微生物中获得CPR噬菌体培养的可能性。鉴于分离和基于宏基因组学的研究都报道了一些噬菌体能够感染不同的细菌门，因此本研究中鉴定的CPR噬菌体的广泛宿主范围值得进一步的实验验证。在这种情况下，应该排除通过水平基因转移获得这种间隔序列的可能性，因为CRISPR阵列(重复序列和连续间隔序列)完全不同。这些结果表明，一旦地下水生态系统中发生了CPR噬菌体的菌间感染，作为胞外共生体的CPR微生物可能会成为自由生活微生物的病毒诱饵。  

我们进一步研究了病毒相关功能如何增强CPR/DPANN宿主的代谢和生存能力。大约有10个与4个宿主谱系(Microgenomatia、Paceibacteria、Dojkabacteria和ABY1)相关的CPR噬菌体和7个感染2个谱系(Altiarchaeota和EX4484-52)的DPANN病毒编码Concanavalin/LamG结构域蛋白。同源性建模和结构预测表明，这些病毒蛋白可能参与共生体与自由生活微生物的细胞粘附，表明病毒在CPR/DPANN生物体的附着或生物膜形成中发挥作用。许多与不同的CPR/DPANN谱系相关的病毒(ABY1、Dojkabacteria、Microgenomatia、Paceibacteria、Micrarchaeota和EX4484-52)编码涉及糖基化修饰的糖基转移酶。与CPR/DPANN生物类似，糖基转移酶基因在它们的病毒中也很常见，表明病毒通过增强宿主糖、多糖和糖蛋白的生物合成能力，在细胞附着和细胞表面环境调节中具有潜在的辅助作用。此外，在CPR/DPANN病毒中也发现了一些AMGs。例如，在CPR/DPANN病毒中检测到与嘧啶代谢相关的DUT基因和与蛋氨酸降解相关的DNMT1基因，这表明病毒对代谢能力有限的CPR/DPANN微生物的适应有贡献。

图3. CPR细菌和DPANN古细菌宿主多种与共生有关的病毒。（A)基于CRISPR和基于原病毒的方法鉴定的CPR/DPANN病毒基因共享网络。病毒的宿主分类是通过颜色来区分的。(B)Gracilibacteria噬菌体上的原间隔物与来自非CPR门(拟杆菌门)宿主的CRISPR间隔物连接。(C)来自CPR/DPANN病毒的细胞表面修饰基因和其他功能基因示意图。噬菌体图标旁边的数字表示带有相应基因的病毒数量。病毒与CPR/DPANN门之间的连接线表示病毒与宿主之间的预测联系。

参与甲烷、氮、硫和磷循环的病毒辅助代谢基因

病毒AMGs可能通过改变甲烷、氮、硫和磷的代谢直接影响生物地球化学过程。在甲烷代谢方面，在5个vOTUs中发现了5个pmoC(一种在甲烷营养微生物中广泛存在的甲烷氧化基因)，但未发现与甲烷生成相关的AMGs。甲烷作为地下水中常见的微量成分，可以被甲烷营养或甲基营养微生物作为能量来源氧化。携带pmoC基因的病毒可能在感染周期内促进微生物甲烷氧化以产生能量。系统发育表明，病毒可能通过两次转移事件从γ变形菌和α变形菌中获得pmoC。在我们的研究中，从γ变形菌中获得的病毒pmoC基因与最近在湖泊大型噬菌体中发现的病毒pmoC基因形成了一个病毒特异性分支，这表明这些在地表和地下淡水中的病毒pmoC基因可能在过去有一个共同的起源。据我们所知，病毒pmoC之前曾在湖泊和土壤中被报道过，但在地下水中没有发现。  

对于氮循环，在三个vOTUs中鉴定出两种反硝化AMGs(nirK和norB)，这意味着病毒可能参与了含水层的反硝化作用。系统发育表明，这些反硝化AMGs可能是从变形菌门和拟杆菌门转移过来的。病毒norB和nirK基因已在海洋样本中被发现，但在地下水生态系统中尚未报道。1114个vOTUs中4种硫循环AMGs (cysH、cysD、dsrE和sat)表明地下水病毒可能促进异化硫酸盐还原/氧化和同化硫酸盐还原。CysD和sat基因参与硫酸盐还原/氧化过程中将SO4-转化为APS。有趣的是，最丰富的硫循环AMGs是cysH基因(n = 1149)，它参与了将PAPS还原为SO32-的过程。cysH病毒的宿主主要包括变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、CPR细菌、绿弯菌门和一些古细菌，系统发育进一步支持了cysH从这些微生物类群向病毒的水平转移。病毒相关的cysH基因已经越来越多地在人类和其他环境系统中被发现，并且有望在地下水生态系统中作为硫循环参与者显示出巨大的潜力。此外，从1741个vOTUs中鉴定出6种磷循环AMGs (ppa、phoA、phnD、phnE、pstS和phoH)，表明病毒辅助代谢在无机磷溶解、有机磷矿化和磷运输中的重要性。作为两种主要的磷获取策略，编码无机焦磷酸酶的病毒ppa可能通过催化焦磷酸盐水解成磷酸而赋予宿主获得磷酸盐，而编码碱性磷酸酶的病毒phoA可能从顽固的磷酸同酯中释放生物可利用的磷酸盐。系统发育分析表明，病毒ppa来自弯曲菌门、Verrucomicrobiota和拟杆菌门，病毒phoA可能主要来自放线菌门和变形菌门。病毒pstS和phnD/phnE可能分别参与宿主磷酸盐运输和膦酸盐运输。最丰富的磷循环AMGs是phoH基因(n = 1661)，该基因编码一种磷酸盐调节蛋白，可在磷饥饿下诱导。这些AMGs，如病毒性ppa、phoA、phnD、phnE、pstS和phoH，在地下水中很少报道，尽管它们在以前的地表环境研究中被注意到。不同的磷循环AMGs可能对地下水病毒协助宿主应对限磷胁迫具有重要意义。

图4. 潜在的病毒对甲烷、氮、硫和磷的微生物代谢的影响。（A）参与甲烷、氮、硫和磷代谢的病毒AMG的数量。原核代谢途径中病毒辅助代谢的概念图。在GWVC中识别的病毒AMG在灰色框中以斜体突出显示。AMG相关的甲烷、氮、硫和磷的代谢途径用不同的颜色来区分。(B)参与原核代谢途径的病毒辅助代谢概念图。在GWVC中识别的病毒AMG在灰色框中以斜体突出显示。AMG相关的甲烷、氮、硫和磷的代谢途径用不同的颜色来区分。

结论

总体而言，我们建立了迄今为止最大的地下水病毒目录，包含280,420种病毒，并在大陆尺度上揭示了地下水生态系统中99%以上的新病毒和约95%的新病毒群。我们的研究将目前已知的含水层病毒种类扩大了约10倍，并将地下水中已知病毒感染的原核生物门的数量增加了一倍。病毒-宿主关系分析表明，地下水中以关键微生物(CPR细菌和DPANN古细菌)为代表的小细胞微生物共生体更容易被病毒裂解。值得注意的是，CPR噬菌体似乎能够感染自由生活的细菌门，并且CPR/DPANN病毒有助于细胞与自由活细胞的共生粘附。与甲烷、氮、硫、磷代谢相关的病毒AMGs可能直接参与宿主代谢和生物地球化学循环。这项研究为了解地下水中尚未被开发的病毒世界提供了巨大的机会，并强调了地下病毒圈对未来病毒生态学研究的重要性。