开发耐噬菌体大肠杆菌菌株的系统策略

  噬菌体在涉及细菌的工业发酵过程中被认为是一种强大的拮抗剂。尽管细菌已经发展出多种防御机制来对抗噬菌体感染，比如预防噬菌体吸附、阻断噬菌体DNA注射、抑制噬菌体DNA复制和流产感染机制等，但这些机制大多数只对特定范围的噬菌体有效，对广泛的噬菌体感染能力有限。

  近期，《NATURE COMMUNICATIONS》发表了一篇题为《Systematic strategies for developing phage resistant Escherichia coli strains》的研究文章，介绍了一种通过整合基于DNA磷硫化的Ssp防御模块和噬菌体生命周期所必需成分的突变来开发耐噬大肠杆菌菌株的策略。该研究中，工程大肠杆菌表现出对不同噬菌体高达106倍的保护作用，具备稳定的噬菌体抗性表型，且不影响细菌的生长能力。

  该研究通过将来自E. coli 3234/A的sspBCDE基因组转化到缺乏内源ssp基因的E. coli K-12 MG1655中，并使用载体pWHU3640进行表达，评估了基于PT的Ssp防御系统在实验室和工业生物过程中的性能。结果显示，在E. coli MG1655中引入SspBCDE防御系统可以在不同程度上提供对大多数噬菌体的保护，甚至达到六个数量级的保护水平。此外，引入SspBCDE系统还导致斑点大小明显减小，并改变斑点形态(图1)。

  图1. 实验室和工业大肠杆菌菌株中对SspBCDE防御的验证

  此外，EOP数据证实，噬菌体T5对SspBCDE防御不敏感，这被认为与T5 DNA双步注入宿主细胞的不寻常过程有关(图2)。

  图2. 工程抗噬菌体(EPR)大肠杆菌菌株的构建

  为了达到对T5和T7的足够耐受性，对MG1655-PT菌株中对这些噬菌体感染周期至关重要的元素进行了修饰。通过整合基于PT的SspBCDE防御系统和突变FhuA和TrxA基因，可以构建具有广泛耐受性的大肠杆菌菌株。这些工程菌株对多种噬菌体表现出强大的抗性，包括T1、T4、T5、T7、EEP、JMPW2和lambda。此外，这些工程菌株在高噬菌体滴度下也能保持细胞的完整性，不发生裂解。这表明，通过整合SspBCDE防御系统和FhuA和TrxA基因的突变，可以有效地构建耐受广泛噬菌体的大肠杆菌菌株(图3)。此外，这些工程菌株的细胞生长和生产性能未受到明显的抑制，展示了潜在的工业应用前景。

  图3. 用噬菌体处理的MG1655-EPR菌株在一定MOIs范围下的生长曲线

  图4. EPR大肠杆菌株在富含噬菌体的摇瓶振荡培养或喂料饲养方法中的重组蛋白生产中的应用

  进一步，通过构建大肠杆菌菌株(MG1655-EPR和W3110-EPR)来产生d-氨基酸氧化酶(DAAO)，以及通过构建大肠杆菌菌株(MG1655(DE3)-EPR)来产生冠状病毒SARS-CoV-2非结构蛋白(nsp8)。实验结果显示，这些工程菌株表现出强大的耐受性，并且能够持续生长和维持目标蛋白的产生。此外，MG1655-EPR和W3110-EPR菌株在受到高滴度的噬菌体攻击下仍然表现出强劲的增长能力，并产生了与没有噬菌体攻击的菌株相当的DAAO活性。对于表达nsp8的MG1655(DE3)-EPR菌株，大多数的蛋白质以可溶性形式存在，并在噬菌体存在的条件下保持了高产量(图4)。

  此外，这些工程菌株在约400次转移后仍保持了强大的噬菌体抗性和目标蛋白的产生能力，展示了它们的基因组和发酵稳定性。该研究通过在大肠杆菌中构建EPR菌株，评估了它们在补料分批发酵过程中对噬菌体攻击的耐受性。实验结果表明，在分批发酵过程中，EPR菌株(MG1655-EPR(pGEMKT-DAAO)、W3110-EPR(pGEMKT-DAAO)和MG1655(DE3)-EPR(pWHU6404))相对于对照菌株表现出更好的生长能力和DAAO活性。即使在高浓度的噬菌体鸡尾酒存在下，EPR菌株仍能保持良好的细胞生长和目标蛋白(DAAO和nsp8)的产生能力。此外，EPR菌株在分批发酵过程中的溶解氧浓度曲线与对照菌株相似，进一步表明它们的耐受性和生长特性。通过连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)的检测结果显示，EPR菌株的基因组在噬菌体存在的环境中保持了稳定性和完整性(图4)。

  综上所述，这些实验结果表明EPR菌株是潜在的工业应用中具有高水平噬菌体抗性的大肠杆菌宿主，可用于大规模生产异源蛋白。

  参考文献：https://doi.org/10.1038/s41467-022-31934-9