基于液滴编码-配对的微流控多重数字化LAMP实现临床样本中多种病原的高通量检测

原创

来源：邹晶晶

2023-03-08 00:00:00

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核心提示：多路复用能力是目前数字化核酸分析（Digital nucleic acid analysis, DNAA）的主要攻克方向。2023年广州市第一人民医院刘大渔课题组基于此研究背景，开发了一种基于液滴编码-配对的微流控多重数字化LAMP技术，并以下呼吸道感染（LRTI）和尿路感染（UTI）检测组作为研究对象，实现多种病原的同步定量检测。

DNNA是一种绝对定量分析方法，反应原理是通过将样本分散成大量的pL-nL体积的分区，再对每个分区的终点二进制读数进行泊松统计分析，从而实现目标核酸的绝对定量。目前，DNAA方法在多重能力检测方面受到限制。这种局限性在病原检测应用中尤为明显，这是由于一种感染通常涉及多个候选病原体，因此多路检测能力对于及时的循证决策至关重要。目前，基于DNNA的多重策略大致可分为3类：1)“一色一靶”：使用不同激发波长的荧光基团去标记探针或者修饰引物实现不同靶标的检测，这种模式高度依赖于检测平台中可用的荧光通道数量;2)不同的荧光强度：反应体系中加入不同浓度或者比例的荧光探针或引物，扩增结束后含有不同靶标的反应单元的荧光强度不同;3)探针混合：以指定的比例混合探针，为每个反应单元创建一个独特的荧光特征信号。后两种策略需要在热力学特性/化学动力学方面进行广泛的优化。这种调节优化过程颇为繁琐，所需要的仪器、试剂和时间成本也较大，这对高通量应用来说是一个不容忽视的挑战。此外，其存在的分辨率问题也妨碍了准确的定量。

最近，科研人员也开发了几种自定义的多重DNAA，包括1)基于数字PCR的扩增曲线、熔融曲线分析。这些方法有效地扩展了DNAA的多路复用能力，然而仍需广泛的优化来获得具有特定扩增/熔融曲线的扩增子，且还需平衡扩增效率(引物共存于一个反应单元中)。此外，还需要专用的仪器来实时监测每个反应单元。2)锁式探针，利用每个核酸目标与不同荧光团结合的两个分子信标的特定结合位点比例进行编码，已用于多重数字滚动循环扩增。这种方法具有无限的多路复用容量的潜力。然而，当一个液滴含有多个目标分子时，可能会产生误导性的结果。3)在微流控芯片上构建分区，特定的区域检测特定的靶标。这种策略往往只需要一个荧光通道即可简单实现多重检测，然而由于微流控芯片的物理尺寸限制，其通道扩展能力有限。

液滴微流控在液滴操作方面具有较高的灵活性，如液滴编码、捕获、配对和合并，使其成为扩展DNAA的理想平台。基于此，广州市第一人民医院刘大渔课题组发展了一种基于液滴编码-配对的微流控多重数字化核酸分析(Multiplexed droplet digital loopmediated isothermal amplification, mddLAMP)方法，用于LRTI和UTI细菌的检测。图1展示了此方法的操作流程：i)引物液滴编码，向不同引物溶液中分别添加特定比例的三原色染料，每种颜色对应一种引物。利用“十”字结构液滴生成芯片分别将不同引物溶液分散形成引物液滴(d=80 μm)，混合后形成引物液滴文库;ii)样品分散，同样利用液滴生成芯片将样品分散形成样品液滴(d=130 μm)，并捕获于“葫芦”形微坑的大坑;iii)液滴配对，向芯片引入引物液滴，并捕获于“葫芦”形微坑的小坑，因而引物液滴和样品液滴在“葫芦”形微坑中配对。在这里，利用机器视觉获取引物液滴颜色-位置-数量信息;iv)液滴融合，外加电场使引物液滴和样品液滴融合;v)LAMP反应后进行荧光成像，以识别、枚举和定位阳性液滴;vi)扩增反应后利用机器视觉获取液滴荧光信号-位置-数量信息，结合对应位置引物液滴的颜色-数量信息，依据泊松分布算法实现多重数字化分析。作者首先基于美术三原色原则和比色LAMP技术筛选出了三种染料：橙黄G(ORG);酚红(PR);溴百里酚蓝(BTB)，并验证了这三种染料(400 μM)对于dLAMP的生物兼容性。继而优化了这三种染料的配比，得到八种RGB值差异显著的颜色，用于编码引物液滴。在这里，作者也表征了液滴的捕获-配对-融合效率(图2)。另外，作者基于机器视觉开发了液滴解码程序，该程序能够实现配对后引物液滴和反应后阳性液滴的精准识别-定位-计数，并依据阳性液滴位置信息溯源引物液滴颜色-数量信息，从而实现微流控多重数字化核酸分析(图3)。在这里，识别结果也表明不同颜色编码的引物液滴数量趋近相同，为捕获液滴数量与检测通量的商值。因而这种多重数字化核酸分析方法可以通过扩大微坑阵列规模来保证用于每个靶标检测的有效液滴单元数量，进而保证多重数字化核酸分析的定量精度。为避免定量精度不够，作者表征了所建立微流控芯片(10,000和50,000)的动态检测范围，数学模型显示，量化精度随着目标数量的增加而降低(单重到10重)，但是微坑数为10,000的小尺寸芯片已能满足LRTI和UTI病原检测标准。然后，作者展示了引物的特异性并证明了芯片上不存在交叉反应，以及使用八种细菌gDNA混合样本表征该多重dLAMP分析方法的绝对定量能力：混合样本中测定的细菌核酸拷贝数与商品数字PCR仪OsciDrop的定量值间呈现良好的线性相关性(详见图4)。最后，研究利用临床样本对mddLAMP方法实际应用能力进行验证，结果显示mddLAMP方法的病原检测结果与常规检测方法一致(图5)。因而，所建立的多重dLAMP方法具有很好的临床应用能力。

总的来说，本文的主要创新点在于利用液滴编码-配对扩展数字化核酸分析的信息通量。液滴编码-配对技术以下三方面特征能够有效扩展数字化核酸分析的信息通量：(1)基于三原色组合的编码策略具有无限的编码容量;(2)液滴随机配对-融合过程可以产生大量不同内涵液滴组合，从而同步形成全面的检测组;(3)机器视觉能够识别的颜色信息上限：224。

图1 mddLAMP操作流程图。

图2 A)调配的八种引物液滴的颜色在RGB空间内的分布(每个椭圆表示数据集的 95%置信区间，每个簇为n=30);B)指示染料(400 μM)对mddLAMP检测定量精度的影响;C-E)液滴捕获、配对和融合的显微照片;F)液滴捕获、配对和融合的效率。(n = 3个技术重复，比例尺= 500 μm)。

图3 基于机器视觉的液滴解码程序。A)解码工作流程示意图;B)混淆矩阵比较机器学习与人工识别的颜色分类结果(3次统计结果);C)颜色编码的引物液滴在微坑阵列芯片的分布情况。红色虚线表示理论平均值(12.5%，n = 3个技术重复)。

图4 A，B)测量精度的数学模型;C，D)具有代表性的亮场和荧光显微照片，显示了LRTI(肺炎链球菌)和UTI(无乳链球菌)检测面板中使用的LAMP引物对输入的细菌gDNA的特异性;E)浓度梯度稀释核酸混合样本的多重dLAMP结果(明场和荧光图片相叠加)，NTC为无模板对照;F)mddLAMP测定的核酸浓度与商品数字PCR仪定量值间的线性相关性。