基于碳纳米管的可逆比率荧光探针实现焦磷酸盐光学检测

引言

无机焦磷酸盐(PPi, P₂O₇⁴⁻)在生物系统中起着至关重要的作用。它是细胞内DNA和RNA合成以及三磷酸腺苷(ATP)水解等生化反应的主要副产物之一。因此，它与生物能量储存过程密切相关，并已成为测量端粒酶活性用于癌症诊断的重要生物标志物。此外,过量的PPi可能会促进与骨骼和关节相关的疾病。因此,检测和定量PPi具有重要意义,相应的探针的开发一直是近年来研究的热点。

在这项工作中,作者介绍了利用定制的sp³功能化(6,5) SWNTs作为NIR-II窗口内的荧光探针,实现对PPi的直接和定量检测。研究发现,修饰有荧光缺陷的(6,5) SWNTs对Cu²⁺离子表现出高度敏感,导致E11和E11*发射的强烈猝灭。这种猝灭效果可通过加入铜离子络合物如PPi而被逆转,可通过多种光谱指标进行定量监测。E11缺陷诱导发射相对于E11本征发射的强度比是最稳定可靠的PPi检测指标。进一步证明,使用磷脂质-聚乙二醇包覆的生物相容性SWNTs探针,能够在复杂生物介质(如细胞裂解液)中可靠地定量检测PPi,并可用于快速光学监测聚合酶链反应过程中释放的PPi,这为其潜在应用提供了证明。

结果与讨论

1、sp³功能化SWNTs和荧光探针设计

为了制备能检测PPi的sp³功能化SWNTs,首先通过水性两相提取(ATPE)法分离出(6,5) SWNTs,并用十二烷基硫酸钠(SDS)分散在水溶液中。随后,通过添加4-乙基苯重氮四氟硼酸盐将SWNTs进行sp³功能化。得到的具有4-乙炔苯基sp³缺陷的(6,5) SWNTs(记为Dz-alkyne)除了988 nm处的本征E11发射峰外,还出现了1135 nm附近红移的sp³缺陷诱导E11发射峰。然后,向Dz-alkyne分散液中加入硫酸铜五水合物和三羟丙基三唑基甲胺(THPTA)形成Cu²⁺配合物(记为{Cu})。加入{Cu}后,E11和E11*发射都显著降低,发射峰也发生红移。值得注意的是,E11发射的减弱程度更大,导致E11*/E11发射强度比下降。

为探究猝灭过程的机理,添加EDTA,迅速恢复了功能化SWNTs的光学性质。这种可逆猝灭过程为利用sp³功能化SWNTs作为生物相关和强铜络合分子(如PPi)的发光探针奠定了基础。在{Cu}的作用下,SWNT荧光探针进入关闭状态,PL强度显著降低,峰位也发生红移。加入PPi可完全恢复初始的发射性质,使探针重新处于开启状态。

2、PPi的定量检测

作者测试了对PPi的定量检测。15 μM的{Cu}加入到Dz-alkyne SWNTs分散液中,并在不同浓度的PPi下分别记录PL谱。据此,可以获得PPi在水溶液中的校准曲线,E11和E11*发射随PPi浓度的增加而逐渐恢复。值得注意的是,E11*/E11峰强比随PPi浓度增加而上升,并在高浓度下保持稳定。此外,E11*和E11峰位也表现出与PPi浓度良好的相关性。所有这些指标都表现出在100 μM-10 mM的广泛检测窗口内与PPi浓度的良好相关性。

3、sp³功能化SWNT探针的选择性

进一步测试了功能化(6,5) SWNTs作为PPi荧光探针的选择性。所测试的弱铜络合分析物(如阴离子)只引起微小的PL响应变化,而已知与Cu²⁺形成强配位的分子(如PO₄^3–、柠檬酸根、ADP、ATP、PPi)则显示PL强度比和E11*强度均有显著提高。PPi对此仍然最敏感。此外,研究发现这种探针还能区分ATP和PPi的混合比例,为追踪ATP水解反应动力学提供了新方法。

4、SWNTs探针在复杂生物样品中的应用

作者用功能化SWNTs检测HEK293T细胞裂解液中的PPi。即使在包含细胞代谢产物和蛋白质的复杂生物样品中,E11*/E11强度比仍能与PPi浓度呈良好的线性关系。检出限可达34 μM。此外,将Dz-alkyne SWNTs探针加入PCR反应体系,实时记录PL谱。随PCR循环次数的增加,E11*发射峰的强度逐渐增强,与PPi浓度增加导致的趋势一致。

结论

作者设计了基于sp³功能化(6,5) SWNTs的NIR-II荧光探针,用于定量检测生物重要分子焦磷酸盐(PPi)。这一探针基于Cu²⁺离子可逆地与探针表面的配位作用,诱导荧光猝灭,可被PPi等配位性强的分子逆转。关键的是,sp³缺陷诱导的E11*发射相对于本征E11发射的变化模式为可靠的比率测量提供了基础。研究证明了这种SWNTs探针不仅可以在水溶液中定量检测PPi,还可用于复杂生物样品和动态生化过程的光学监测。这种基于SWNTs的可靠比率发光探针为生物标记物的合理设计提供了良好的起点。

参考文献

Settele, S., Schrage, C. A., Jung, S., Michel, E., Li, H., Flavel, B. S., . . . Zaumseil, J. (2024). Ratiometric fluorescent sensing of pyrophosphate with sp³-functionalized single-walled carbon nanotubes. Nature Communications, 15(1), 706. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45052-1.