从基因剪刀到超灵敏传感器：丁酸梭菌Argonaute驱动的多重检测技术

1. 引言

随着全球粮食生产和人类迁徙的增加，食源性疾病和传染病的发生率上升，迫切需要评估危害因素以确保公共安全。霉菌毒素、抗生素、病原体和病毒等危险因素是重要的食品污染物，因此建立灵敏、准确的检测平台至关重要。传统的检测方法包括仪器分析（如高效液相色谱和液相色谱-质谱）、免疫测定（如酶联免疫吸附试验）和分子诊断（如聚合酶链反应），但这些方法各有局限，如高成本、复杂操作和时间消耗等。

为了解决这些问题，开发一种通用、快速、多元的检测平台显得尤为重要。基于CRISPR和相关蛋白的传感器作为新型生物传感系统，虽然具备快速、准确的检测优势，但在适应性和多路检测方面存在挑战。相比之下，Argonaute（Ago）蛋白作为一种新兴的基因编辑工具，能够通过小核酸向导特异性切割目标核酸，并克服CRISPR系统的一些限制。

本研究设计了一种丁酸梭菌Argonaute驱动的可编程平台，使用磁性纳米颗粒四面体 DNA 编码系统，用于非核酸靶标的超灵敏和多重检测。研究人员通过引入识别元件（抗体、适配体等），这些策略可以对许多非核酸靶标做出反应，从而说明了所开发的基于Ago的传感器的通用性（图1a）。对于病原菌的检测，我们使用适配体作为识别元件，整个分析过程中不需要提取DNA。进一步引入TDNA@MNP编码系统作为载体，提高了CbAgo系统的解理效率，加速了HCR（图1b）。gdna激活的CbAgo可以在DNA四面体功能化的磁性纳米颗粒上进行初始DNA （iDNA）的靶向切割（iDNA-TDNA@MNPs），从而允许靶向阻断不同的hcr（含有不同荧光基团修饰的发夹）。TDNA@MNPs上的hcr可以改变上清中荧光发夹的数量。磁分离后，记录上清液中荧光强度的变化，用于目标定量。为了实现多路检测，我们设计了不同的dna来触发CbAgo对不同TDNA@MNPs的dna的切割作用。随后，TDNA@MNPs上出现了带有荧光团标记的不同hcr，从而改变了上清中不同荧光发夹的数量。最后，通过测量上清液荧光强度的变化，可以对各种靶标进行量化（图1c）。

图1. 检测传感器原理

2. 结果与讨论

基于cago的解理系统

研究表明，丁酸梭菌Argonaute（CbAgo）能够结合特定的gDNA，并在37°C的中等温度下激活裂解活性。为构建裂解体系，研究团队设计了相关序列并通过凝胶电泳验证了gDNA对CbAgo裂解活性的诱导效果。使用荧光猝灭（FQ）探针作为指示剂，实验显示荧光强度随着gDNA浓度的增加而增强，证明了gDNA激活裂解活性的可行性。

为了检测非核酸靶标，研究者提出了一种完整的抗原导向核酸探针（gDNA-BSA-Target），通过化学偶联将gDNA与完整抗原结合，利用抗体与抗原的特异性识别建立非核酸靶点与gDNA的定量关系。以黄曲霉毒素B1（AFB1）为例，分析结果表明gDNA成功偶联到BSA-AFB1偶联物。通过不同成分的样品验证，发现仅存在FQ和CbAgo时荧光强度较弱，而在添加gDNA-BSA-AFB1后，荧光强度显著增加，表明发生了裂解反应。这些结果证明了gDNA-BSA-AFB1偶联物的成功合成以及其激活CbAgo切割的可行性（图2）。

图2. 构建AFB1检测APP平台。(a)可编程CbAgo解理。(b)聚丙烯酰胺凝胶电泳（14%）分析(CbAgo: 100、50、10 μg /mL；gDNA: 100 nM；tDNA: 200 nM)。(c) gdna驱动CbAgo切割FQ的原理。(d)不同浓度gDNA与CbAgo和FQ混合后的荧光强度。(e) cbago介导的荧光信号读出系统的反应动力学。(f) gdna - bsa - afb1驱动CbAgo切割FQ的原理。(g) gDNA、BSA-AFB1和gDNA-BSA-AFB1的紫外曲线。(h)不同样品组合的荧光强度：(1)FQ, (2) FQ + CbAgo, (3) FQ + gDNA-BSA-AFB1, (4) FQ + CbAgo + gDNA-BSA-AFB1。

APP平台用于检测非核酸靶点

DNA四面体因其独特的结构特性，能够调节核酸探针的分布密度和取向，成为核酸探针结合的理想材料。通过减少不必要的表面效应（如探针间的拥挤和纠缠）并保持良好的稳定性，DNA四面体可以有效地实现靶结合（如CbAgo与ssDNA之间的识别）。因此，研究团队将DNA四面体装载到磁性纳米颗粒（MNPs）表面，以构建高效的反应载体，适用于多种反应，如无酶杂化链反应（HCR）。

研究首先合成了具有生物素修饰的四面体DNA纳米结构，并将其组装在链亲和素修饰的MNPs表面，形成iDNA-TDNA@MNPs。通过动态光散射（DLS）和ζ电位分析，确认了纳米配合物的合成。结果显示，与MNP-streptavidin相比，iDNA-TDNA@MNP的ζ电位有所变化，表明探针成功合成。

进一步分析发现，gDNA-BSA-AFB1偶联物成功激活了iDNA-TDNA@MNP上的CbAgo切割活性，并触发了HCR，改变了上清液中荧光探针的数量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和共聚焦激光扫描显微镜观察到HCR反应成功，且荧光强度随iDNA浓度增加而增强。这些结果表明，TDNA的存在显著提高了HCR和CbAgo切割反应的效率，从而为多靶标检测提供了新的平台（图3）。

图3. AFB1检测APP平台。(a) TDNA@MNP编码系统的原理。(b) SA-MNP和dna - tdna -生物素-SA-MNP的Zeta电位。(c) iDNA-TDNA@MNP的SEM和(d)元素映射图。(e)聚丙烯酰胺凝胶电泳（14%）分析：(1)标记，(2)H1, (3) H2, (4) iDNA, (5) H1 + H2, (6) H1 + H2 + iDNA（低浓度），(7)H1 + H2 + iDNA（高浓度）。(f)荧光磁珠的共聚焦激光扫描显微镜图像。(g)不同样品组合的荧光强度：(1)iDNA-TDNA@MNP, (2) iDNA-TDNA@MNP + CbAgo, (3) iDNA-TDNA@MNP + gDNA-BSA-AFB1, (4) iDNA-TDNA@MNP + CbAgo + gDNA-BSA-AFB1。(h)聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%）分析TDNA。(i) iDNA@MNP和iDNA-TDNA@MNP的HCR效率。(j) iDNA@MNP和iDNA-TDNA@MNP的CbAgo裂解效率。(k)竞争性免疫测定提供gDNA-BSA-AFB1的原理。(l) AFB1检测APP平台的线性范围。(m)对不同干扰真菌毒素（1 ng/mL）的特异性考察。(n) APP平台、HPLC和ELISA检测玉米样品中AFB1的比较。

真菌毒素的多重检测

基于Ago的生物传感技术展示了通过多个gDNA进行多目标监测的潜力。研究利用APP平台同时检测三种真菌毒素：AFB1、AFG1和DON，采用不同的荧光团和独立的gDNA实现多路检测。在最佳条件下，该平台对AFB1和AFG1的线性范围为10 pg/mL至100 ng/mL，对DON为100 pg/mL至1 µg/mL，检测限分别为5.48 pg/mL、4.88 pg/mL和59.65 pg/mL。

与商用ELISA相比，APP平台在灵敏度和线性范围上表现更佳。此外，APP平台无需复杂的样品前处理，能够同时检测多种真菌毒素，显示出与HPLC相似或更高的灵敏度和准确性（图4）。相较于CRISPR/Cas系统，CbAgo体系简化了设计过程，降低了成本，提高了稳定性和适用性，扩大了应用范围。

图4. 用于真菌毒素（AFB1、AFG1、DON）多重检测的APP平台。(a)基于cago的真菌毒素多重检测原则。(b)不同荧光基团的激发和发射波长。(c) AFB1、AFG1和DON的标准曲线和(d)线性范围。（e-g） APP平台和HPLC检测三种真菌毒素不同浓度玉米样品（20个阳性样品和10个阴性样品）中AFB1、AFG1和DON的比较。

多种病原体检测

为了验证APP平台检测非核酸靶点的通用性，研究团队利用该平台对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌进行多重检测。与抗体检测真菌毒素不同，这项研究采用适配体作为识别元件。结果表明，APP平台对单个细菌的灵敏检测与qPCR方法相当，且具有广泛的线性范围。在优化反应条件后，APP平台在复杂系统中也表现出良好的检测能力，线性范围为10²-10⁷ CFU/mL，检测限分别为46 CFU/mL（大肠杆菌）、59 CFU/mL（金黄色葡萄球菌）和70 CFU/mL（鼠伤寒沙门氏菌）（图5）。与CRISPR/Cas系统相比，APP平台克服了对PAM/PFS的依赖，使用更稳定、经济的gDNA，显著提高了多目标检测的灵敏度和效率。最终，APP平台显示出良好的实际应用前景。

图5. APP平台多重检测病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌）。(a)以适体为基础的竞争制度原则。(b)基于cbag的病原体多重检测原理。(c)标准曲线和(d)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的线性范围。（e-g） APP平台与平板计数法检测医院标本中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌的比较。

3. 总结

本研究设计了一种丁酸梭菌Argonaute驱动的可编程平台，使用磁性纳米颗粒四面体 DNA 编码系统，用于非核酸靶标的超灵敏和多重检测。研究人员表达并纯化了可在37℃下工作的丁酸梭菌Argonaute（CbAgo），并开发了基于磁性纳米颗粒四面体DNA编码系统的可编程平台，用于多路检测非核酸靶标。该平台具有三个主要优势：1）在37°C下扩展了非核酸靶标检测能力；2）通过增强结构稳定性和无酶杂化链反应提高灵敏度；3）实现等温条件下的多路检测。研究首次报道了基于Ago的非核酸靶标检测传感器，具有高灵敏度和多路复用能力，为基因编辑技术在分子诊断中的应用开辟了新途径。

论文链接：https://doi. org/10.1016/j.cej.2024.149548.