用于细菌超灵敏和同步检测的电阳性磁性荧光纳米探针介导的免疫层析测定

1. 引言

病原菌感染是人类健康的一大威胁，导致许多严重疾病，每年全球数百万人死亡。及时鉴定病原体对于准确治疗至关重要，但现有的检测技术如细菌培养、PCR和基因组测序存在操作复杂、耗时和昂贵的缺点。因此，迫切需要一种快速、简单的现场检测技术。免疫层析检测（ICAs）是流行的护理点检测技术，但现有的细菌ICA方法灵敏度和通量低，主要因为抗体制备和选择困难，以及纳米探针在复杂样品中的稳定性问题。近年来，研究人员开发了无抗体生物传感器，利用无抗体纳米探针提高灵敏度和稳定性。然而，这些方法仍然面临挑战，如探针与细菌结合机制不明确、检测通量不足以及检测极限较高。基于细菌细胞的负电性特征，研究人员尝试开发具有广谱结合能力的无抗体纳米探针，以解决ICA灵敏度和准确性问题。尽管取得进展，但仍需要进一步改进以满足临床诊断的需求。

本研究报道了一种基于无抗体纳米探针MagMQD@Si的通用免疫层析（ICA）平台，用于临床样本中细菌的超灵敏和同步检测。如方案一所示，该探针通过连续涂覆多层量子点和一层氨基改性的二氧化硅，设计为具有优越的荧光性质、强磁响应性和高表面正电荷。探针通过静电相互作用与负电细菌细胞结合，并利用外加磁场快速富集。该ICA系统是一个典型的捕获-检测两步系统。首先，将探针加入测试样品中，利用磁场富集细菌。然后，将富集的复合物滴在ICA条的样品垫上，开始免疫层析检测。三种抗菌抗体分别喷涂在NC膜上，以构建用于同时检测三种目标细菌的三个检测线。当测试样品包含靶细菌时，形成的探针-细菌复合物通过抗体和抗原的特异性结合被相应的检测线捕获，产生明显的荧光信号。这种方法实现了病原体的定性和定量检测。

方案1. a)电正性MagMQD@Si⁺探针的制备示意图和b)同时检测三种目标细菌的无抗体纳米探针ICA原理图。

2. 结果与讨论

电阳性MagMQD@Si⁺探针的表征

研究人员通过透射电子显微镜（TEM）确认了MagMQD@Si的纳米结构。结果显示，Fe₃O₄磁性纳米颗粒（MNPs）具有均匀的200 nm粒度，通过PEI改性后表面电位变为正电荷。大量量子点被吸附在MNPs表面，形成多层结构。薄的氨基改性二氧化硅壳层（约2 nm）被包覆在MagMQD表面，提高了其表面电位。元素扫描和映射证实了多层量子点和SiO₂壳层的存在。

图1. MagMQD@Si⁺探针的形态表征。

研究人员通过X射线光电子能谱（XPS）分析了MagMQD@Si的表面组成，确认了其元素丰富性和无杂质。氨基改性二氧化硅壳层提供了强的正电特性、改善了流动性，并保护了内部量子点。薄SiO₂壳层对磁响应性影响最小，且在复杂环境中保持稳定。MagMQD@Si在高盐浓度和酸性条件下表现出优异的稳定性，且在60天内保持荧光强度。这些特性使其成为理想的磁选工具。

图2. 两种不同SiO₂厚度（2 nm和40 nm）的MagMQD@Si⁺的比较

电阳性MagMQD@Si⁺对细菌捕获和检测能力评价

研究人员设计了正电性MagMQD@Si⁺探针，利用静电相互作用广谱捕获细菌。该探针在10秒内与细菌结合，并在5分钟内达到99.0%的捕获效率。与抗体修饰探针相比，MagMQD@Si⁺的捕获能力更高，反应速度更快。它对多种常见病原体（包括李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等）表现出高于91%的捕获效率，证明其作为通用富集工具的实用性。

图3. 电阳性MagMQD@Sⁱ⁺对细菌捕获能力评价

研究人员利用正电性磁性探针MagMQD@Si开发了一种多重ICA平台，用于同时诊断常见病原体。该平台通过评估不同浓度的样品，证明了其选择性和多通道检测能力。SEM图像显示，荧光信号来自MagMQD@Si与细菌-抗体复合物的形成。通过优化参数，如抗体浓度和孵化时间，该平台实现了快速检测（15分钟），包括5分钟的磁捕获和10分钟的试纸反应时间。

图4. 电阳性MagMQD@Sⁱ⁺对细菌检测能力评价

基于MagMQD@Si⁺的ICA平台检测性能评价

研究人员评估了MagMQD@Si基于ICA的分析性能，发现其对三种目标细菌（铜绿假单胞菌、肺炎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌）的检测限分别为8、31和40 cell/mL。与传统的AuNP-ICA相比，该方法的灵敏度提高了25-125倍。通过与免疫磁量子点@硅探针比较，MagMQD@Si⁺探针在T线上产生更强的荧光信号，提高了视觉灵敏度。SiO₂涂层提高了探针的流动性和检测性能，几乎消除了背景信号。

图5. 基于MagMQD@Si⁺荧光ICA检测多种致病菌的分析性能

研究人员评估了MagMQD@Si基于ICA的特异性和重现性。结果表明，该方法对目标细菌（铜绿假单胞菌、肺炎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌）具有高度特异性，13种非目标细菌未产生荧光响应。通过检测混合细菌样品，验证了该方法的选择性。重现性测试显示，六批独立制备的样品产生均匀的荧光信号，变异系数≤5.38%。该方法在复杂样品（咽拭子和湖水）中表现出稳定的准确定量能力，平均回收率在90.82%至107.69%之间。

图6. 基于MagMQD@Si⁺的ICA特异性评价

基于MagMQD@Si⁺的ICA在真实临床标本中的应用

研究人员将阳性纳米探针介导的ICA技术应用于真实临床呼吸道标本的诊断。他们收集了23个铜绿假单胞菌阳性和7个肺炎链球菌阳性痰样本，并通过qPCR和痰涂片进行验证。结果表明，ICA方法与qPCR具有相同的准确性，但只需1/9的检测时间（20分钟）。该方法比传统的ELISA和PCR更简单、更快速，具有发展成为细菌通用检测平台的潜力。

图7. 基于MagMQD@Si⁺的ICA对临床真实呼吸道标本的检测结果

3. 总结

本研究设计了一种基于正电性MagMQD@Si的超灵敏荧光ICA平台，用于细菌诊断。该平台的无抗体探针由一个Fe₃O₄磁芯、多层量子点荧光内壳和薄的氨基官能化SiO₂壳层组成，提供强磁响应性和优越的荧光信号。这种探针对各种病原体具有通用的结合能力和高亲和力。通过与载有抗体的试纸条结合，研究人员在多通道ICA系统中实现了对不同致病菌的灵敏和特异性诊断，显著提高了检测性能并降低了成本和难度。该ICA技术能够在15分钟内高度灵敏地定量检测铜绿假单胞菌、肺炎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌，检测限分别为8、31和40 cell/mL。与传统的基于AuNP的比色ICA相比，检测限降低了25-125倍，动态范围扩大了两个数量级以上。在真实世界样品中，研究人员通过检测40份临床痰液样品验证了该平台的有效性，结果与金标准（qPCR和平板培养）100%一致。这些发现表明，该阳性探针ICA在细菌感染的现场筛查和临床诊断中具有良好的应用前景。

论文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202412421