诺如病毒（Noroviruses, NoVs）是全球急性病毒性胃肠炎的主要病因，占全球爆发事件的近50%，每年导致约7亿例病例。这些感染导致每年5万名儿童死亡，主要发生在医疗资源有限且医疗访问受限的低资源环境中。诺如病毒是直径约38 nm、属于卡利奇病毒科的正链单股RNA病毒，其衣壳由一个主要的结构蛋白VP1组成。诺如病毒分为GI至GV五个基因组，其中GII.4悉尼2012是主要流行株，占爆发事件的80%。诺如病毒的临床与经济影响十分显著。全球范围内，与诺如病毒感染相关的医疗保健成本据估计每年高达600亿美元。随着诺如病毒的流行持续构成重大的公共卫生挑战，亟需研发快速高效的诊断工具，以减轻其对公共卫生及经济造成的冲击。

已建立的检测方法包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及快速免疫层析法。虽然RT-PCR具有高度的敏感性和特异性，但其耗时较长，需要熟练的人员，并依赖于复杂设备和劳动密集型过程，如样本富集、核酸提取和纯化，这限制了其可及性。ELISA在常规诊断中广泛应用，但需要经过培训的人员和集中的设备。相比之下，快速免疫层析提供了一个更快捷、更用户友好的选择，然而其较低的灵敏度常常导致结果不准确。为了更好地控制诺如病毒感染的传播，迫切需要简单、快速、敏感的诊断解决方案，以解决这些传统技术的局限性。

生物免疫传感器提供了一种更便捷、更具成本效益和便携性的替代方案，使其适用于广泛部署。近年来生物传感技术的进步，包括针对诺如病毒衣壳蛋白VP1的光电化学（PEC）免疫传感器以及利用VP1特异性抗体在金电极上的电化学传感器，已展现出高灵敏度和高选择性。病毒样颗粒（VLPs）是纳米尺度结构（10-100 nm），它们在缺乏感染性遗传物质的同时复制了原生病毒的形态。它们独特的内在稳定性和精确呈现多价配置的抗原或表位的能力，使它们在免疫传感器开发中具有高度优势。VLPs可以通过化学或基因修饰来显示高密度的抗体结合表位，进一步提高了分析测试的性能。这些特性在HuNoV纳米传感器中得到了应用，其中VLPs模仿了原生病毒，而没有感染风险。

尽管VLP作为疫苗候选品因其类似病毒的大小、重复和有序的结构以及非传染性而得到了很好的确立，但它们作为标准化免疫测定诊断参考材料的潜力尚未得到充分开发。这些VLPs可以被整合到生物传感平台上，作为参考纳米材料，能够精确地与工程化的生物受体相互作用，从而实现有效地诺如病毒检测。除了VLPs，通过噬菌体展示技术产生的单链可变片段（scFvs）为生物传感应用提供了补充优势。噬菌体展示对于产生针对GII.4诺如病毒和胃肠炎爆发的新型高亲和力scFvs至关重要。这种方法特别重要，因为它允许开发出前所未有的scFvs，并且专门设计用于与GII.4 VLPs结合，这是生产高度敏感生物传感器的关键步骤。迄今为止，针对GII.4诺如病毒VLPs的scFvs开发受到了限制。合成生物学的方面使这些scFvs的优化和工程化成为可能，以增强其结合特性、稳定性和整体性能，这对于生物传感器的功能至关重要。综上所述，VLPs和scFvs的整合利用，不仅为开发高度敏感的生物传感器提供了新的可能性，还通过优化生物传感平台的性能，推动了诺如病毒和其他胃肠炎相关疾病的快速、准确检测，从而在公共卫生和临床诊断领域具有广泛应用前景。

因此，本文提出了一种新型的生物传感方法，该方法利用合成生物学技术构建了一种基于重组蛋白的平台，用于诺如病毒的检测。该策略结合了通过噬菌体展示针对GII.4悉尼2012病毒样颗粒（NoV-LPs）理性选择的单链可变片段（scFvs），这些片段通过杆状病毒表达系统在昆虫细胞中生产，以及作为稳定、非感染性参考生物材料的结构优化NoV-LPs。使用BirA连接酶进行定点生物素化，以保留scFv的取向和功能，从而促进精确固定。这些组件集成到一个小型化的光电系统中，提供了一种可扩展且灵敏的临床诊断解决方案，包括应用于人类粪便样本的应用。

首先，生产及表征病毒样颗粒。使用Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System（BEVS）并进行特定修改（图1A），在Spodoptera frugiperda（Sf9）细胞中表达了GII.4悉尼2012（NoV-LPs）病毒样颗粒。从临床菌株（GenBank MN248513.1）中获取的编码主要壳体蛋白（ORF2）的合成基因被克隆到pFastBac载体中，并被转化到Escherichia coli DH10Bac细胞中。随后将Sf9细胞以感染量（MOI）0.1进行感染。上清液通过离心处理，利用PEG 8000和NaCl形成颗粒，并用Triton X-100、DNase I和PMSF进行处理。通过SDS-PAGE分析评估了纯度和产量。此外，NoV-LPs通过透射电子显微镜和冷冻电子显微镜进行了表征。详细的实验方法和额外数据在补充数据中提供。

接下来，生产及表征针对诺如病毒脂蛋白的scFv抗体。采用噬菌体展示技术筛选得到针对诺如病毒GII.4 Sydney 2012的特定重组scFv抗体，并通过BEVS（图1B）进行生产，具体方法详见补充数据。纯化的scFv通过SDS-PAGE和Western blot分析进行表征。scFv的生物素化采用BirA连接酶。结合动力学通过生物层干涉仪进行测定，使用Ni-NTA生物传感器，scFv的加载浓度为0.05 μg/mL，生成的诺如病毒脂蛋白（NoV-LPs）在0.5至4.2 μM的系列稀释度下进行测试。

图1 (A) NoV-LP生产方案的示意图；（B）噬菌体展示技术在特异性scFvs选择中的应用。

作为分析支持，该检测在微型DVD上以微阵列格式进行。非接触式打印设备将50 nL的NoV-LP和scFv抗体溶液（溶于PBS）以及阳性和阴性对照点样至盘片表面。BSA（40 mg/L）作为阴性对照，生物素化scFv作为阳性对照。盘片在4℃下孵育过夜。对于夹心检测，向微阵列中加入50 μL人粪便标本（PBST中10%溶液）。15分钟后，用PBST清洗微型DVD。随后加入50 μL生物素化scFv抗体溶液（2.5 mg/L），再孵育15分钟。然后通过加入50 μL链霉亲和素-HRP溶液（1:1000，溶于PBST）并进行15分钟孵育来显色免疫反应。最后加入50 μL TMB，5分钟后用水终止反应。在竞争检测中，NoV-LP与不同浓度（0-10^6 fM）的生物素化scFv抗体溶液混合，孵育30分钟。随后，采用与夹心检测相同的方法进行竞争检测，包括加入链霉亲和素-HRP和TMB。最终，光电系统（图2）扫描微型DVD，并定量蓝色斑点的吸光度，其对应病毒载量浓度，以Ct值表示。该生物传感器的详细描述见补充材料。简言之，该生物传感器采用商用盘片读取器（LG GH24NSC0）和650 nm激光扫描微型DVD（半径=4 cm），以5.5 μm分辨率实时检测NoV-LP与scFv的结合，产生的信号与样品中的病毒载量成正比。该信号被快速处理，可在45分钟内同时分析最多8个样品，无需DNA扩增。该系统提供Ct等效值以实现病毒载量的精确定量，并已针对诺如病毒的夹心和竞争免疫检测进行优化。

图2 (A)进行检测的迷你DVD平台图片；（B）带有分析平台并在托盘中扫描光盘的光电生物系统。

开发的关键一步，以准确可靠的病毒载量定量为参考，表征了诺如病毒样颗粒（NoV-LPs）。第一阶段涉及使用BEVS生产NoV-LPs，使重组VP1衣壳蛋白能够自我组装成空心的非感染性颗粒，这些颗粒在外源性抗原性和形态上与天然病毒颗粒非常相似。为了进行形态学表征，将0.1 mg/mL浓度的NoV-LPs使用透射电子显微镜和冷冻电子显微镜进行分析（图3A），以确定它们的完整性、纳米颗粒大小、结构以及每个NoV-LPs中的VP1拷贝数。形态学分析显示，纳米颗粒测量38 nm，与天然病毒颗粒的大小相同。诺如病毒衣壳由VP1蛋白组成，这些蛋白可以组装成不同的结构组织。此外，占主导地位的GII.4人类诺如病毒衣壳的原子结构显示，VP1蛋白的灵活性和可塑性是其内在特性，使这种结构适应性成为可能。重要的是，T = 4 NoV-LPs的对称性和三维组织为高密度结合位点提供了可能，这为开发敏感的诺如病毒生物传感器提供了巨大潜力。

为了进一步评估诺如病毒样颗粒（NoV-LPs），进行了SDS-PAGE分析，通过将不同量的NoV-LPs（1.0、2.0和5.0微克）加到12%丙烯酰胺凝胶中，然后使用Coomassie蓝染色（图3A）。结果显示，58kDa处出现了一个蛋白带，呈现出双峰模式。这些结果表明成功生产了NoV-LP纳米颗粒，这些纳米颗粒可能作为生物传感器的参考纳米材料，提供卓越的稳定性和多个结合位点，从而为其在免疫传感中的潜在应用奠定了基础。杆状病毒因其能够进行必要的真核修饰、产生高产且可扩展且成本效益的生产，以及能够在VLP形式中表达具有必要结构完整性的复杂、多亚基蛋白，因此成为VLP生产的最佳合成生物学系统。

下一步，进行ScFV抗体针对诺如病毒-LPs的表征。通过BEVS技术生成重组scFv对于提高敏感性并实现筛选至关重要。图3B中的上方图像展示了可变轻链（VL）区（泳道1）和重链（VH）区（泳道2）的PCR产物电泳结果，分别获得了约400 bp的片段。这些产物被合并用于构建scFv。通过使用长连接序列（GGSSRSSSSGGGGSGGGG）将两个结构域连接，最终构建了800 bp的scFv表达载体（泳道3）。获得PCR产物后，使用SfiI酶切，将其克隆至噬菌体载体pComb3X中，随后通过电转化方法将其导入XL1-Blue感受态细胞。随后，表达scFv库，并通过使用辅助噬菌体VCSM13的噬菌体展示筛选出针对NoV-LP的scFv-NoV GII.4克隆。为了实现无不良后翻译修饰的高产量和大规模表达所选择的scFv克隆，采用了BEVS系统。通过SDS-PAGE和Western印迹分析（图3B）对特定scFv进行表征。电转移分析显示在预期分子量为25 kDa处出现一条明显的带，表明成功表达。在三个独立的生产运行中观察到100%的重现性，如第5、6、7泳道所示，从而验证了表达系统的可靠性。最终，获得每升昆虫细胞培养物约4.0 mg的NoV-LP特异性scFv，产量良好。

图3 表征A) 类病毒样颗粒和B) scFv抗体。A) 左图：经电镜观察的NoV-LPs（类病毒样颗粒），显示球形颗粒。内嵌图：SDS-PAGE分析纯化的NoV-LP，泳道1、2和3分别对应1.0、2.0和3.0微克的VLP。右上角：冷冻电镜重建的NoV-LP（T=4 二十面体对称），包含240个VP1拷贝。B) 左图：琼脂糖凝胶电泳分析scFv噬菌体库的组成部分：泳道1，VH基因片段；泳道2，VL基因片段（VLκ）；泳道3，通过PCR组装得到的scFv-NoV-LP产物；泳道bp，1000 bp DNA标记。中心：SDS-PAGE和考马氏亮蓝染色显示在洗脱液分数中scFv（约25 kDa）的选择性过表达（泳道5–7）。底部右侧：针对NoV-LPs的特异性scFv的电转移分析，泳道1–4显示上清液、流穿液和洗涤液，泳道5–7显示洗脱液。

 为进一步探究校准方法和分析性能，生物传感器通过设置两种免疫测定格式（竞争和夹心），并使用所产生的NoV-LPs作为参考材料以及scFv作为捕获和检测组分，进行了评估。该过程如图4A的实验设计图和微阵列图像中所示。主要目的是证明，使用微阵列格式和适当的固定免疫试剂，可以在同一平台上同时进行竞争和夹心测定，并比较它们的性能。为了评估两种格式，进行了14次重复，每个生物传感器包含8个微阵列，每个试剂重复两次。选择变量和试验条件，包括试验试剂的浓度和孵育时间，进行了系统优化，以平衡灵敏度、重复性和总试验时间。

如图4A所示，固定在表面的NoV-LPs信号随着竞争性测定中NoV-LPs浓度的增加而降低，而在夹心测定中，固定在表面的scFv信号随着NoV-LP浓度的升高而增加（0, 100, 10², 10⁵ fM）。使用NoV-LPs作为参考物质进行Norovirus检测时，竞争性测定和夹心测定两种方法的校准曲线均显示出极好的相关性，其中夹心法的结果更为一致（图4B）。与竞争性测定相比，夹心法显示出更高的灵敏度（LOD = 0.5 fM），其定量范围为1.0 fM至10 pM，且具有良好的重复性（11%）。这种双重能力突显了生物传感器的灵活性及其在Norovirus检测之外更广泛诊断应用中的潜力。

在确认了 sandwich 格式的高灵敏度之后，评估了其估算人类粪便样本中病毒载量的能力，使用 NoV-LPs 作为参照材料。遵循了两步校准方法来关联生物传感器信号与 RT-qPCR 结果。首先，使用含有 VP1 基因的合成质粒建立标准曲线，以将 RT-qPCR Ct 值与已知的基因组拷贝数（拷贝/μL）相关联。如图 4C 插图所示，这种校准在 10² 至 10⁸ 拷贝/μL 范围内表现出线性响应。其次，根据其分子结构估计每微升中的 NoV-LPs 数量，以将生物传感器信号强度与等效基因组拷贝相关联。每个 NoV-LP 由 240 个 VP1 蛋白组成。将此转换为特定浓度（例如，0.5 fM）每微升的摩尔浓度，并应用阿伏伽德罗常数，结果约为 300 个颗粒/μL。假设每个颗粒相当于一个基因组，将此颗粒计数与 qPCR 校准中使用的相应基因组拷贝数相匹配。通过将基于颗粒的生物传感器响应与基于基因组的 qPCR 曲线对齐，关联了生物传感器信号与等效 Ct 值。得到的 S 形校准曲线允许在动态范围内估算病毒载量，该范围对应于 10 至 25 的 Ct 值，检测限相当于 32 的 Ct 值。虽然这种转换基于 VLP 颗粒数与基因组拷贝数之间的假设等价性，但它为在此概念验证背景下将生物传感器结果与 qPCR 得到的 Ct 值进行比较提供了一个基于生物学原理且实用的方法。

为评估该生物传感器在病毒载量定量中的鲁棒性，对从瓦伦西亚大学临床医院采集的20份5岁以下儿童的粪便样本，采用所开发的生物系统及RT-qPCR进行了分析。每份样本均进行双份检测，并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证（，生物传感器给出的结果通过将强度信号插值至校准曲线，以Ct当量值表示。生物传感器数据对应于两天内进行的六次重复实验。所有RT-qPCR阴性样本（样本6、9、12和19）均被生物传感器持续鉴定为阴性（Ct > 32）。在16份RT-qPCR阳性样本中，14份在两种方法间表现出一致的Ct当量值，相对误差≤15%。然而，样本1和5的相对误差超过20%，表明尽管该生物系统可靠地区分阳性与阴性样本，但在少数情况下其精确量化病毒拷贝数的性能可能欠佳。值得注意的是，未检测到假阳性或假阴性结果，实现了100%的临床敏感性和特异性，且与RT-qPCR结果高度相关（r = 0.945）（图4D）。平均相对误差为11%的结果凸显了该生物传感器作为粪便样本筛查和病毒载量定量的可靠生物系统的潜力。因此，所报告的变异性不仅涵盖了各方法的精密度，还包括了日间差异及平台间差异。由于qPCR衍生的Ct值为对数形式且固有变异性，在此背景下相对误差被认为是可以接受的，特别是对于一项仅证明技术可行性的概念验证研究，而非全面临床验证。

选择性评估是通过分析人阴性粪便样本（包括NoV GIII和人类轮状病毒感染样本）以及添加Norovirus GII.6 VLPs和SA11株 strain的RNA病毒（RNA virus A）至浓度为1.0 pM的阴性样本来进行的。结果如图4E所示。观察到，在盘上开发的免疫测定法显示出高选择性，有效地区分了不同病毒种类和类型引起的感染，从而确认了所产生的scFvs具有很强的选择性。光学电子生物系统对NoV GII.4显示出高度选择性检测。

图4 免疫传感器的校准与分析性能。A）不同浓度的诺如病毒脂蛋白（NoV-LP）的竞争性（顶部行）和夹心（底部行）检测的微阵列图像：图板I、II、III和IV分别代表0、10⁰、10²和10⁵ fM。B）竞争性（红色，虚线）和夹心（黑色，实线）检测的校准曲线，诺如病毒脂蛋白浓度以fM（底部坐标轴）和病毒颗粒拷贝/μL（顶部坐标轴）表示。C）免疫传感器的校准曲线显示信号强度为Ct等效值的S型函数。插图：标准曲线展示了定量PCR检测中Ct值与病毒DNA质粒浓度（拷贝/μL）之间的关系。D）散点图与回归线比较了光学生物传感器和RT-qPCR在诺如病毒检测中的Ct等效值之间的相互方法差异。E）选择性实验。条形I、II、III、IV、V、VI和VII分别对应诺如病毒GII.3、诺如病毒GII.4、诺如病毒GII.6、诺如病毒脂蛋白GII.3；诺如病毒脂蛋白GII.6、轮状病毒A、轮状病毒A-VLP和阴性对照样本。除了阳性样本外，Ct值均低于32。

综上所述，本研究成功生产并表征了诺如病毒GII.4类病毒样颗粒（NoV-LPs）和高亲和力重组抗体（scFvs），将其整合到DVD基生物传感器中，用于高度敏感和特异性检测诺如病毒GII.4。NoV-LPs的T = 4对称性和3D组织提供了高密度结合位点，增强了生物传感器的性能。这些结构上模仿天然病毒粒子的非感染性纳米颗粒作为可靠的参考材料。将高亲和力scFvs的整合进一步提高了夹心法格式的检测能力。开发出的生物传感器展现出卓越的诊断准确性，与RT-qPCR Ct值强相关，阳性样本的相对误差为11%，临床敏感性为100%。尽管样本量有限且不足以得出明确的临床结论，但这是一项概念验证研究，旨在展示平台的技术可行性。

此外，本研究揭示了合成生物学驱动方法在诊断生物传感器开发中的潜力。噬菌体展示、杆状病毒表达系统和细菌转化的结合使得高效和规模化蛋白质生产成为可能。在昆虫细胞中使用杆状病毒表达确保了类似于哺乳动物的翻译后修饰，这对于VLP的生产至关重要，而噬菌体展示则促进了高亲和力scFv的生成。此外，细菌转化提高了简单蛋白质生产的成本效益和规模化，从而增强了下一代重组诊断工具的规模化和经济可行性生产。这个综合的合成生物学管道，结合噬菌体展示、杆状病毒表达载体系统和基于DVD的光电技术，提供了一种与传统ELISA和标准生物传感器平台相比，新型且有前景的替代方案。这种方法不仅提高了敏感性和选择性，而且支持了下一代重组诊断工具的大规模和经济上可行的生产。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117787