病原菌的检测一直是全球公共卫生和环境安全的重要问题，已持续数十年。在美国，每年因水源性疾病影响的超过700万人，造成巨大的经济负担。革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌和微球菌，在土壤、水资源、医院等环境中普遍存在，并能引起人类感染。金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌能迅速导致食品腐败和毒素产生，引发食物中毒。因此，快速且准确地检测革兰氏阳性细菌对于环境监测至关重要。

众多传统方法，如细菌培养、聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），已被用于细菌检测。细菌培养方法可靠，适用于细菌的增殖和分析，但对于某些细菌而言，其耗时且具有挑战性，限制了实时检测。PCR虽然敏感，是诊断感染性疾病的标准方法，但需要昂贵设备和高技能技术人员，耗时且易发生污染。ELISA以其特异性抗体检测特定抗原而闻名；然而，在复杂样品中可能会出现交叉反应，其灵敏度也受限。

在各种生物传感平台中，电化学生物传感器因其最佳检测限、与诊断读取器的经济有效集成以及仪器的低功耗要求，而被首选用于检测病原体。在本研究中，一种基于亲和力的电化学生物传感器被用于克服传统检测方法的限制。该生物传感器通过目标细菌与识别分子（肽）之间的特异性结合产生电化学信号，从而实现快速、高度敏感的多种细菌同时检测。

为了进一步提升该生物传感器的导电性和信号放大效率，引入了一种由MXene-Ti₃C₂T_z和金纳米粒子-AuNPs组成的纳米复合材料。Ti₃C₂T_z提供了卓越的电导性和巨大的表面积，极大地提高了电极的电子传输效率。AuNPs通过其生物相容性和高导电性增强了电化学信号。本研究探讨了AuNPs@Ti₃C₂T_z纳米复合材料的导电性、稳定性以及选择性结合能力，以及该复合材料在电化学信号放大的作用。

此处所展示的生物传感器平台，基于AuNPs@Ti₃C₂T_z基抗污纳米复合材料，经夹心肽修饰后，能够定量革兰氏阳性菌，且易于实现多重检测。基于肽的生物传感器作为革兰氏阳性菌检测最可靠的手段之一，在磷酸盐缓冲液人工条件下进行了表征，并采用污染环境水样对生物传感器进行了验证。本研究表明，基于高通量16通道金圆盘电极（16GDEs）的亲和电化学生物传感器，能够实现革兰氏阳性菌的快速准确检测，并具有应用于环境监测与临床诊断的潜力。

16-GDEs的制造过程描绘了微制造技术的主要步骤（图1a-f）。16-GDEs被分为两组：电极和聚甲基甲丙烯酸甲酯（PMMA）室。电极的制造分为三步。第一步，DNR-L300-D1被涂覆在带有导电铬和金的玻璃载玻片（83 × 34 mm）上。在DNR-L300-D1涂覆后，在95 °C的热板上进行了90秒的热处理。接下来，DNR-L300-D1涂覆在镀金的玻璃载玻片上，使用掩模对准器MDA-400M在紫外光下曝光18秒，以创建所需的图案。然后，后曝光烘烤（PEB）在110 °C进行了180秒。准备好的电极用AZ 300 MIF Developer进行了15秒的显影处理。在图案转移的显影后，曝光的金层用Au蚀刻剂进行了30秒的湿蚀刻，铬层用Cr蚀刻剂进行了15秒的湿蚀刻（图1a）。

在第二步中，通过剥离过程制备了Ag参考电极，并使用超声波浴在丙酮和70%甲醇中处理5分钟，以去除剩余的负光刻胶。接着在硅片上旋涂正光刻胶，旋涂速度为3000 rpm，持续20秒。随后，对正光刻胶进行软烘焙，接着在掩模对齐器中对硅片进行曝光，并立即进行两次PEB，第一次温度为90°C，持续1分钟；第二次温度为110°C，持续1分钟。PEB后，使用AZ 300 MIF显影剂对光刻胶进行显影，以防止参考电极区域外的Ag沉积（图1b）。接下来，使用SPT-20 ION-COATER在图案化基板上沉积了50nm厚的Ag，然后使用丙酮去除基板上除参考电极区域外的Ag（图1c）。

在第三步中，绝缘层的制备过程采用的是负光刻胶SU-8 2002，通过旋涂法将其涂覆在基板上，然后在65°C的条件下进行软烘焙2分钟。随后，放置一个直径为500微米的16环光掩模，接着对UV光进行7.9秒的曝光，随后用SU-8显影剂处理8秒（如图1d所示）。通过以上步骤，成功制备了具有16个高通量16-GDEs结构。最后，参考电极用0.05M的水合FeCl₃溶液处理30秒，形成Ag/AgCl层。然后将其整合到一个16通道的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）室中（如图1f所示）。此外，使用适配器将导电的16-GDEs垫与EmStat Pico MUX16电位计通过PSTrace软件连接起来。

图1 a–f) 在专门讨论电极设计与制造的章节中，提供了一种用于制造高通量16通道金盘电极（标记为16-GDEs）的工艺概述。

接下来，进行了金纳米粒子@Ti₃C₂T_z在16-GDEs表面的表征。通过扫描电子显微镜（SEM）对16-GDEs表面制备的AuNPs@Ti₃C₂T_z的形貌结构进行了分析。如图2所示，AuNPs@Ti₃C₂T_z呈现出层状、薄片、类似手风琴的架构，透明纳米薄片以多层方式堆叠，并被AuNPs所装饰。AuNPs呈现出多面体状结构，分布在Ti₃C₂T_z上，横向尺寸约为50 nm。能量色散X射线光谱学（EDS）映射（图2c-g）进一步证实了AuNPs@Ti₃C₂T_z的形成，其中Ti₃C₂T_z和AuNPs@Ti₃C₂T_z的Au含量分别为0.9和25.43%（质量比）。在16-GDEs表面，与单独的Ti₃C₂T_z相比，AuNPs@Ti₃C₂T_z表面的Au覆盖率令人满意，AuNPs浓度约为28.26倍更高。元素映射证实了Au、Ti、C和Cl原子在整个结构中的均匀分布，表明AuNPs与Ti₃C₂T_z在16-GDEs表面的成功相互作用。

为表征AuNPs@Ti₃C₂T_z的电学性能，在[Fe(CN)₆] ^3−/4−溶液中进行了循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）测试。如图2j所示，两种电极类型的奈奎斯特图显示，16-GDEs的传质电阻（Rct）值为41.92 ± 0.99 kΩ，而AuNPs@Ti₃C₂T_z/16-GDE的Rct值显著较低（7.54 ± 0.15 kΩ），这归因于纳米复合材料的引入。AuNPs提供了更大的有效表面积，并增强了生物传感器表面的电荷转移动力学。图2i中观察到的CV信号改善，是手风琴状Ti₃C₂T_z结构和AuNPs催化活性的协同效应所致，两者共同提升了电化学性能。具体而言，CV（图2i）结果表明，与Ti₃C₂T_z/16-GDEs和16GDEs相比，AuNPs@Ti₃C₂T_z/16-GDEs表现出更高的电化学氧化还原峰电流。

图2 a–g) 典型AuNPs@Ti₃C₂T_z/16-GDEs表面的扫描电镜（SEM）图像及空间分辨元素EDS图谱。h) 采用滴涂法制备AuNPs@ Ti₃C₂T_z /16-GDEs的示意图。生物传感器表面改性的电化学表征。i) 在[Fe(CN)₆]^3−/4−溶液（1:1；5 mm）中含1 mm KCl条件下，16-GDEs及AuNPs@ Ti₃C₂T_z的循环伏安（CV）曲线。j) 同一条件下的电化学阻抗谱（Nyquist）图。图中Rct以虚线表示。柱状图代表平均值（n=3），误差线表示标准偏差。

研究人员继续使用一对亲和肽的夹心型设计开发了基于亲和力的电化学生物传感器。利用金纳米粒子@ Ti₃C₂T_z的优异的电化学生物传感器特性，构建了一种基于包覆电极的敏感电化学夹心结构肽生物传感器（图3）。纳米复合物增强了导电性，而肽的高亲和性在样本与表面接触时减少了非特异性结合。生物素标记的检测肽和辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素被引入，以便在实验开发过程中提供更大的灵活性。此外，进行了多项优化实验以确认HRP和金纳米粒子与Ti₃C₂T_z共轭的必要性。结果表明，金黄色葡萄球菌与表面的相互作用是浓度依赖的，在生物素标记的检测肽浓度约为25 μg/mL和链霉亲和素-HRP浓度为250 ng/mL时达到最佳检测灵敏度。此外，由负对照（NC）条所示的非特异性相互作用在整个过程中保持较低水平，表明生物传感器对金黄色葡萄球菌具有较高的特异性，并揭示了纳米复合物表面涂层有效的抗污性能。

图3 革兰氏阳性菌电化学检测示意图。

使用了一种基于捕获肽纳米复合材料的电化学生物传感器用于革兰氏阳性菌检测，如前所述。实验构建通过夹心ELISA得到验证，从而确认了革兰氏阳性菌与捕获肽的特异性结合及其与连接至链霉亲和素-HRP的生物素化检测肽偶联物的相互作用。为定量评估密集型亲和电化学生物传感器的灵敏度和准确度，通过改变革兰氏阳性菌浓度研究了生物传感器电流的变化（图4a,c,e）。观察到的峰电位偏移可能源于AuNPs@ Ti₃C₂Tz电极的结构特性，通过细菌相互作用影响电荷或质量转移阻力。在低浓度下，这些相互作用可能导致了局部电荷非均匀性，从而引起偏移。观察到生物传感器的峰电流变化与革兰氏阳性菌对数浓度在5×10¹至10⁶ CFU/mL范围内呈强线性关系（图4b,d,f），回归线的调整R平方值（Adj. R-square）≥0.96。基于线性回归分析结果，该生物传感器对革兰氏阳性菌的检出限被估计为实验LOD值：金黄色葡萄球菌（5×10¹ CFU/mL）、蜡样芽孢杆菌（5×10¹ CFU/mL）和金黄色链霉菌（5×10² CFU/mL），这些值低于US-FDA BAM的革兰氏阳性菌检测限。金黄色葡萄球菌、金黄色链霉菌和蜡样芽孢杆菌LOD之间的差异主要归因于其形态差异。金黄色葡萄球菌形成菌簇，增加了传感器表面的局部细菌密度，增强了电子转移和灵敏度，而金黄色链霉菌不聚集，导致电化学响应的LOD为500 CFU/mL。

图4 在磷酸盐缓冲液（0.1 m，pH = 7.5）中，不同浓度的a) S. aureus（5 × 10¹ CFU mL−1 – 10⁶）、c) B. cereus（5 × 10¹ CFU mL−1 – 10⁶）、e) M. luteus（5 × 10² CFU mL−1 – 10⁶）的DPV响应。对数据应用线性回归拟合，得到b) S. aureus的Adj. R-square值为0.973，d) B. cereus的Adj. R-square值为0.967，f) M. luteus的Adj. R-square值为0.956。数据点代表平均值（n = 3），误差条表示标准偏差。

此外，通过检测加入淡水样本中的革兰氏阳性细菌（图5）评估了生物传感器数组的准确性。观察到生物传感器峰电流变化与靶革兰氏阳性细菌对数浓度之间存在线性关系，调整后决定系数（Adj. Rsquare）值≥0.93。这种相关性在相关环境样品范围5×10²至5×10⁵ CFU/mL内明显。这些发现表明，基于亲和力的生物传感器能够准确且可靠地检测淡水样品中超过500 CFU/mL的革兰氏阳性细菌浓度。这些结果符合美国食品药品监督管理局（US FDA）对革兰氏阳性细菌样本设定的接受范围。

图5 基于AuNPs@Ti₃C₂T_z/16-GDEs的夹心肽结构革兰氏阳性生物传感器。a)金黄色葡萄球菌，b)蜡样芽孢杆菌和c)金黄色微球菌生物传感器在稀释自来水中(5 × 10² – 5 × 10⁵ CFU/mL)的响应。数据点表示平均值(n=3)，误差线表示标准偏差，金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色微球菌的调整R平方分别为0.996、0.931和0.943。

在此基础上，建立了金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌或金黄色微球菌环境样本高通量检测方法。为了展示能够在单一芯片上复用三种生物传感器的能力，每个电极分别被功能性化，用于特异性捕捉金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌或黄曲霉菌的独特的捕获肽（图6a-d）。在每种条件下进行的三次独立实验中，观察到了最小的交叉反应性。

进行了额外实验，以检测环境样品中混合接种的多种革兰氏阳性菌（图6e）。为验证三种革兰氏阳性菌的同步检测效果，构建并测试了四款芯片，具体方法如下：第一块芯片接触未接种细菌的淡水；第二块接触金黄色葡萄球菌；第三块接触金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌；第四块芯片接触接种于淡水中的金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。当引入混合革兰氏阳性菌时，仅在含有靶向革兰氏阳性菌特异性识别捕获肽的平台上观察到峰电流显著增加以及整体电化学生物传感特征的变化。每个传感器的响应与其相应分析物相关。相反，对于在淡水中大量存在且浓度虽仅为纳克级（100 ng/mL）的非靶向分析物，未观察到明显响应。金黄色葡萄球菌生物传感器仅在淡水中产生响应，这可能与存在金黄色葡萄球菌有关。当同时引入金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌时，各自对应的生物传感器均产生相应响应。此外，在添加所有测试细菌时，所有生物传感器均按预期被激活。这表明该平台适用于高通量方法，且不受阵列中电极数量或所用检测方法的交叉反应性限制。

图6 交叉反应性和同芯片上金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和鲁氏不动杆菌的高通量方法研究。a) 含有金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、鲁氏不动杆菌和牛血清白蛋白（BSA）的16种GDEs暴露于PBS中的10⁴ CFU mL⁻¹。条形图表示平均值，误差棒表示标准偏差（n = 3）。附加的统计分析见图S10（支持信息）。下面的示意图表示传感器表面的探针，加上b) 金黄色葡萄球菌，c) 蜡样芽孢杆菌，或d) 鲁氏不动杆菌，导致电化学生物传感器的特异性响应。C. 肽指的是捕获肽。D. 肽指的是生物素化的检测肽。e) 新鲜水中金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和鲁氏不动杆菌的高通量方法。含有四个生物传感器的芯片暴露于新鲜水、鲁氏不动杆菌（5 × 10⁴ CFU mL⁻¹）加入新鲜水；鲁氏不动杆菌（5 × 10⁴ CFU mL⁻¹）和蜡样芽孢杆菌（5 × 10⁴ CFU mL⁻¹）加入新鲜水以及新鲜水中鲁氏不动杆菌（5 × 10⁴ CFU mL⁻¹）、蜡样芽孢杆菌（5 × 10⁴ CFU mL⁻¹）和金黄色葡萄球菌（5 × 10⁴ CFU mL⁻¹）。

综上所述，本研究成功证实了导电AuNPs@Ti₃C₂Tz可被有效集成，以构建具有优异抗污染性能和最小非特异性结合的导电电极层。与先前仅镀覆金纳米簇而非AuNPs@Ti₃C₂Tz的版本相比，该纳米复合材料的制备显著提升了革兰氏阳性生物传感器的灵敏度，同时降低了成本。该纳米复合材料采用单一釜滴涂法进行制备，该方法可通过微阵列生产中常用的自动化加注技术实现规模化放大。此类功能可开发基于亲和力的电化学生物传感器，实现对几乎所有分子分析物的检测。采用具有特异性捕获肽的肽基革兰氏阳性菌生物传感器检测缓冲液和淡水样品中的革兰氏阳性菌，该探针能够实现对目标菌的特异性检测而无交叉反应。最终，将三种生物传感器（金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和藤黄微球菌）在同一电化学生物传感器平台上进行多重检测，构建了革兰氏阳性菌检测原型系统。该高通量系统表现出无交叉反应特性，可并行检测环境样品中的相应分析物。该生物传感平台具有广阔前景，有望革新各类环境检测及不同条件下的多种即时诊断应用。

论文来源：https://doi.org/10.1002/smll.202411486