1.引言

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的病原体，常导致医院内感染和高死亡率，特别是由于其抗生素耐药性。传统检测方法如培养法耗时较长（48-72小时），无法满足快速诊断的需求。近年来，虽然发展了基于核酸或免疫的检测方法，但这些方法存在无法区分死菌和活菌、假阳性和假阴性结果多、成本高等问题。因此，需要一种快速、准确且成本低廉的检测方法，以改善绿脓杆菌的诊断和治疗。

本研究开发了一种基因工程报告噬菌体技术，通过将NLuc萤光素酶基因插入到噬菌体的基因组中，利用其表达NLuc萤光素酶，通过添加底物后产生强烈的发光信号，从而实现对绿脓杆菌的定量检测。具体来说，研究人员首先从绿脓杆菌中分离并鉴定了噬菌体vB_PaeP_PE3，然后利用酵母为基础的噬菌体工程平台，将NLuc基因插入到噬菌体的基因组中，构建了报告噬菌体PE3:KO3:NLuc。通过对该报告噬菌体的性能测试，发现其在感染绿脓杆菌后能够高效表达NLuc萤光素酶，产生可检测的发光信号，从而实现对绿脓杆菌的快速、准确检测。该技术解决了传统检测方法耗时较长、新型检测方法成本较高的问题，为绿脓杆菌的临床诊断和治疗提供了新的有效工具。

2.结果与讨论

工程化噬菌体检测绿脓杆菌的方法开发：通过将NLuc萤光素酶基因插入噬菌体基因组，利用噬菌体感染绿脓杆菌后表达NLuc，结合底物添加产生发光信号，实现绿脓杆菌的定量检测。

图 1 使用工程化噬菌体检测铜绿假单胞菌的开发方法的示意图。噬菌体被改造为包含表达 NLuc 荧光素酶的 NLuc 基因，NLuc 荧光素酶是一种小酶，旨在作为发光报告基因实现最佳性能。该噬菌体对铜绿假单胞菌具有特异性，感染后，它会注射其 DNA 以驱动细菌宿主进行噬菌体复制和在细胞内积累的 NLuc 表达。当细胞裂解时，由于噬菌体感染，噬菌体后代和 NLuc 被释放到培养基中。然后，NLuc可用于催化其底物，以产生可测量的发光产物，与NLuc有关，后代噬菌体将可用于新的感染。

工程化噬菌体PE3:KO3：NLuc在3小时内的检测效能评估：展示噬菌体感染PAO1后NLuc表达随时间增加的检测结果，验证了噬菌体在短时间内有效感染并表达NLuc的能力。

图 2 在 3 小时的时间范围内用报告噬菌体 PE3：KO3：Nluc 检测铜绿假单胞菌 （PAO1）。PAO1 用报告噬菌体（1x10⁵ PFU/mL 终浓度）感染，每小时测量一次产生的信号，长达 3 小时。采用无细菌的报告噬菌体（A）和无噬菌体感染的PAO1（B）作为阴性对照。i） 每次为每个样本获得的 RLU 值。ii） 由时间 0 小时（基线或背景）获得的信号归一化的 RLU 值。当该值高于基线四倍时，该信号被认为是阳性的，并以红色和粗体表示。绿色表示低于基线四倍的值，被视为负值。考虑到较高的细菌浓度会按比例产生较高的发光信号，为了清晰和简单地显示图形，省略了浓度高于 10⁶ CFU/mL 的数据。

7小时内工程化噬菌体PE3:KO3:NLuc的检测灵敏度优化：通过延长孵育时间，实现了在7小时内检测低至10³ CFU/mL PAO1的目标，显著提高了检测灵敏度。

图 3 在 7 小时内用报告噬菌体 PE3：KO3：Nluc 检测铜绿假单胞菌 （PAO1）。PAO1 被报告噬菌体感染，产生的信号每小时测量一次，长达 7 小时。i） 每次为每个样品获得的 RLU 值。ii） 由时间 0 小时（基线或背景）获得的信号归一化的 RLU 值。当该值高于基线四倍时，该信号被认为是阳性的，并以红色和粗体表示。绿色表示低于基线四倍的值，被视为负值。考虑到较高的细菌浓度会成比例地产生更高的发光信号，为了清晰和简单地表示图形，省略了浓度高于 10⁴ CFU/mL 的数据。

样本浓缩后工程化噬菌体PE3:KO3:NLuc的检测限降低：通过将1 mL样本浓缩至50 μL，在7小时内检测到低至10² CFU/mL的PAO1，进一步降低了检测限。

图 4 通过离心浓缩样品后，用报告噬菌体PE3：KO3：Nluc检测铜绿假单胞菌（PAO1）。PAO1 被报告噬菌体感染，产生的信号每小时测量一次，长达 7 小时和 24 小时。采用无细菌的报告噬菌体（A）和无噬菌体感染的PAO1（B）作为阴性对照。i） 每次为每个样本获得的 RLU 值。ii） 由时间 0 小时（基线或背景）获得的信号归一化的 RLU 值。当该值高于基线四倍时，该信号被认为是阳性的，并以红色和粗体表示。绿色表示低于基线四倍的值，被视为负值。样品5 E-1仅在24 h时测量。考虑到较高的细菌浓度会成比例地产生更高的发光信号，为了清晰和简单地表示图形，省略了浓度高于 10⁴ CFU/mL 的数据。

工程化噬菌体PE3:KO3:NLuc在24小时内的特异性检测：展示噬菌体在24小时内特异性检测绿脓杆菌的能力，保持非目标细菌的低背景信号，确保了方法的高特异性。

图 5 通过离心浓缩样品后，在24小时内用报告噬菌体PE3：KO3：Nluc检测不同的细菌（靶标和非靶标）。RLU值由时间0小时获得的信号归一化（基线或背景）。当该值高于基线四倍时，该信号被认为是阳性的，并以红色和粗体表示。绿色表示低于基线四倍的值，被认为是负的。i）目标（阳性）铜绿假单胞菌菌株。ii）来自ESKAPE组的非靶（阴性）菌株。考虑到发光信号与细菌浓度成正比，为了清晰和简单，目标细菌（图 i）的浓度高于 10⁴ CFU/mL 和非目标细菌的浓度低于 10⁶ CFU/mL（图 ii）的数据被省略。

工程化噬菌体PE3:KO3:NLuc在血液样本中的检测应用：在模拟血液样本中，7小时内检测到低至9×10² CFU/mL的PAO1，24小时内检测到低至9 CFU/mL的PAO1，验证了其在临床样本中的检测潜力。

图 6 检测血液中带有报告噬菌体PE3：KO3：Nluc的铜绿假单胞菌（PAO1）。i） 每次为每个样本获得的 RLU 值。ii） 由时间 0 小时（基线或背景）获得的信号归一化的 RLU 值。当该值高于基线四倍时，该信号被认为是阳性的，并以红色和粗体表示。绿色表示低于基线四倍的值，被视为负值。考虑到较高的细菌浓度成比例地产生较高的发光信号，浓度高于 10⁴CFU mL^-1为了图形呈现的清晰和简单，被省略了。

3.总结

本文介绍了一种基于基因工程报告噬菌体的绿脓杆菌快速检测方法。该方法通过将NLuc萤光素酶基因插入噬菌体基因组，实现了绿脓杆菌的高灵敏度检测。与传统方法相比，该技术显著缩短了检测时间（7小时内可检测到10³ CFU/mL，24小时内可检测到低于1 CFU/mL），且具有高特异性。此外，该方法在模拟血液样本中表现出良好的检测效果，验证了其在临床样本中的应用潜力。该技术的优势在于其快速、准确、成本低廉，且无需复杂设备，适用于资源有限地区，有望改善绿脓杆菌的诊断和治疗。

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