1.引言

在《biosensors-11-00027-v2.pdf》研究背景下，生物传感器因快速检测生物分析物的能力在微生物检测中意义重大，核心含特异性识别的生物元件与信号转换的换能器。传统传感器需固定生物识别元件，过程复杂、耗时且成本高，还缩短寿命、严苛存储条件，限制应用。

内溶素可特异性降解目标细菌细胞壁，无需固定即可实现特异性识别，规避功能化瓶颈；光学换能器性能优，多孔硅（PSi）因比表面积大、光学特性独特、成本低，成为常用光学换能器，借 RIFTS 技术可基于有效光学厚度（EOT）变化定量检测。

但传统闭端多孔硅传感器受分析物扩散限制，灵敏度不足（检测限多高于 10³ CFU/mL）、响应慢，难与 PCR、ELISA（检测限达 10 CFU/mL）竞争；而多孔硅膜（PSiMs）为开放式结构，可提升响应速度与灵敏度，成研究热点。

本研究将选择性内溶素与多孔硅膜结合，构建新型细菌检测平台：先以内溶素裂解目标细菌，再借多孔硅膜光学特性检测裂解物。以蜡样芽孢杆菌为模型，用 PlyB221 内溶素验证性能；更换溶菌酶（溶葡萄球菌酶）检测表皮葡萄球菌，证明平台通用性，为多菌株检测传感器开发提供新思路。

2.结果与讨论

该图清晰呈现了 PSiM 的完整制备流程，以 3 英寸高掺杂硅片为起始材料，历经多个关键步骤：通过等离子体增强化学气相沉积（PECVD）沉积氮化硅（Si₃N₄）层并退火；正面进行正性光刻；利用反应离子刻蚀（RIE）打开氮化硅层；阳极氧化形成多孔硅层；热氧化钝化处理；背面正性光刻；最后通过深反应离子刻蚀（DRIE）实现膜的开口。整个制备过程耗时不到一周，可重复进行，仅因铂电极的手动定位可能导致多孔结构存在轻微差异。

图 1：多孔硅膜（PSiM）制备流程示意图

图示检测流程分为三步：第一步，利用选择性内溶素（如 PlyB221）对目标细菌进行裂解；第二步，在 30℃条件下孵育 30 分钟，确保细菌充分裂解；第三步，将细菌溶胞产物流经多孔硅膜，通过光学方法实现检测。整个流程无需对传感器进行功能化修饰，依赖内溶素的特异性和膜的尺寸排阻效应实现细菌检测。

图 2：基于溶胞产物的细菌检测流程示意图

SEM 图像显示，多孔硅膜顶层（传感层）的平均孔径约为 41 nm，标准差为 20 nm，孔隙分布相对均匀。该孔径尺寸经过优化，既能保证细菌溶胞产物（如纳米级碎片）顺利渗透，又能维持膜的机械完整性。若孔径过大，会导致膜的孔隙壁厚度减小，易发生破损；若孔径过小，则会阻碍溶胞产物的渗透，影响检测效果。

图 3：多孔硅膜顶层的扫描电子显微镜（SEM）图像

横截面图像清晰展示了多层多孔硅膜的结构，包括顶层的传感层、中间的对比层以及底层的支撑层。插图为膜顶部的特写，可明确区分传感层与对比层：传感层孔隙较大，对比层孔隙较小。支撑层的部分区域在 DRIE 步骤中被蚀刻去除，因此无法准确测量其厚度和孔隙率；而传感层和对比层的厚度分别为 4.09±0.7 μm 和 22.8±6.8 μm，孔隙率分别为 75.4% 和 48.5%。

图 4：多层多孔硅膜的 SEM 横截面图像

 反射光谱（图 5a）：空气环境（蓝色曲线）和乙醇环境（橙色曲线）下的反射光谱存在明显差异，乙醇环境中的反射峰位置发生偏移，表明多孔硅膜的光学特性对周围介质的折射率敏感。

傅里叶变换图（图 5b）：反射光谱经傅里叶变换后呈现出清晰的峰值，峰值位置与 EOT 相关，空气和乙醇环境下的峰值差异反映了介质折射率变化对 EOT 的影响。

校准曲线（图 5c）：EOT 与折射率变化呈线性关系，拟合方程为 y=5745.8x+4888.4，计算得出传感器的理论灵敏度为 5745.8±847.7 nm・RIU⁻¹，或用 EOT 相对变化表示为 54.4±8.3%・RIU⁻¹。

图 5：多孔硅膜的表征结果（反射光谱、傅里叶变换图、校准曲线）

图 6a（完整细菌）：蜡样芽孢杆菌呈杆状，结构完整，表面光滑，尺寸较大，无法穿透多孔硅膜的孔隙。

图 6b（裂解细菌）：经 PlyB221 内溶素裂解后，细菌结构被破坏，形成大量碎片，其中包含纳米级（<50 nm）的小簇，这些小簇可穿透多孔硅膜的传感层，而较大的碎片则被对比层的小孔径阻挡。

定量分析显示，相同观察区域内，细菌溶胞产物的簇数量是完整细菌的近 20 倍，平均尺寸减小超过 10 倍。

图 6：完整蜡样芽孢杆菌（B. cereus）与裂解后蜡样芽孢杆菌的 SEM 图像

多孔硅层（流动式检测，图 7a）：在 PBS 缓冲液、PlyB221 内溶素溶液和蜡样芽孢杆菌溶胞产物中，1 小时后的相对 EOT 变化分别为 - 0.24%、-0.01% 和 0.05%，均在噪声水平（3σ=1.08%）范围内，无法区分溶胞产物与对照组，检测无显著性差异。

多孔硅膜（流通式检测，图 7b）：PBS 组 1 小时后相对 EOT 下降 0.32%，内溶素组上升 0.28%，均低于噪声水平（3σ=0.84%）；而溶胞产物组的相对 EOT 显著上升，6 分钟后即超过噪声水平，1 小时后达到 2.43%，与对照组存在显著性差异。

图 7：多孔硅层（a）与多孔硅膜（b）的相对 EOT 变化对比图

随着蜡样芽孢杆菌浓度降低，相对 EOT 变化逐渐减小：10⁶ CFU/mL 浓度组 1 小时后相对 EOT 变化显著高于对照组；10⁵ CFU/mL 浓度组的相对 EOT 变化为 0.96%，略高于噪声水平（虚线红线，3σ），与对照组存在显著性差异；10⁴ CFU/mL 浓度组的相对 EOT 变化为 0.64%，低于噪声水平，仅与 PBS 对照组存在显著性差异，与内溶素对照组无显著性差异。因此，该传感器对蜡样芽孢杆菌的检测限为 10⁵ CFU/mL。

图 8：不同浓度蜡样芽孢杆菌溶胞产物的相对 EOT 变化图

表皮葡萄球菌（S. epi.）组：1 小时后相对 EOT 变化为 0.29%，与 PlyB221 内溶素对照组无显著差异，且低于噪声水平，无显著性检测信号。

蜡样芽孢杆菌 + 表皮葡萄球菌混合组：1 小时后相对 EOT 变化为 1.59%，显著高于对照组，但低于纯蜡样芽孢杆菌溶胞产物组的变化值。

纯蜡样芽孢杆菌溶胞产物组：相对 EOT 变化显著高于其他各组，验证了检测的特异性。

图 9：表皮葡萄球菌特异性测试的相对 EOT 变化图

溶葡萄球菌素对照组：1 小时后相对 EOT 变化为 0.26%，低于噪声水平，无显著信号。

表皮葡萄球菌溶胞产物组：30 分钟后相对 EOT 变化即超过噪声水平，1 小时后达到 1.83%，与对照组存在显著性差异，表明传感器成功检测到表皮葡萄球菌溶胞产物。

图 10：表皮葡萄球菌溶胞产物检测的相对 EOT 变化图

2.结果与讨论

本研究成功构建了基于多孔硅膜和选择性溶菌酶的新型细菌检测生物传感器，实现了细菌的快速、特异性、无标记检测。核心成果包括：其一，制备了三层结构的多孔硅膜，通过穿流模式克服了传统闭端多孔硅传感器的扩散限制，显著提升了响应速度和灵敏度，可在 1 小时内检测到 10⁵ CFU/mL 的蜡样芽孢杆菌；其二，利用内溶素的特异性裂解实现检测专一性，避免了非目标细菌干扰，同时通过更换溶菌酶成功检测表皮葡萄球菌，证明了平台的通用性；其三，传感器制备流程简单、成本低廉，无需复杂功能化修饰，符合工业化批量生产需求。

然而，该传感器仍存在改进空间：检测限（10⁵ CFU/mL）需进一步降低以竞争传统技术；多孔硅在水溶液中的稳定性不足导致信号噪声，需通过表面钝化优化；混合样品中未裂解细菌可能堵塞孔隙，影响检测效果。未来可通过优化膜结构、引入纳米材料增强光学信号、集成微流控系统实现多通道并行检测等方式，提升传感器性能，推动其在食品安全、环境监测、临床诊断等领域的实际应用。

论文链接：https://doi.org/10.3390/bios11020027