诺如病毒（Norwalk virus, NoV）是全球范围内导致急性病毒性胃肠炎的最主要原因。人类诺如病毒（hNoV）具有高度传染性，据估计，其感染剂量低至18至1000个病毒颗粒。感染后，个体可长期排出病毒，即使在临床症状缓解后仍能进行无症状传播。诺如病毒传播途径包括人与人之间的接触、受污染的水源和食物来源。病毒可在用于灌溉、饮用和洗食物的水中持续存在，导致病毒传播和暴发。这强调了在预防诺如病毒暴发中监测水和食品安全的重要性。因此，开发针对诺如病毒的快速、灵敏和准确的检测技术对于预防和控制病毒传播至关重要。

近年来，CRISPR/Cas系统在下一代分子诊断技术的发展中展现出了巨大的潜力。特别是在CRISPR/Cas12a系统，一个RNA引导的DNA核酸酶，因其能够特异性识别双链DNA（dsDNA）并引发跨切割活性，从而导致信号放大，而尤为突出。这种能力使其成为RPA终点检测的有效工具。目前，CRISPR分析中的大多数报告工程策略依赖于单一检测模式。然而，双功能指示剂的出现，提供独立且互不干扰的信号，可以相互验证，从而增强系统的抗干扰能力和可靠性，确保测量结果的准确性和可控性。因此，新型CRISPR介导的双模式生物传感系统的开发已成为CRISPR分子诊断领域的一个研究热点。

金属有机框架（MOFs）是一类由金属离子或簇与有机配体自组装形成的多孔晶态材料。这类材料展现出独特的结构特征，包括高度有序的多孔结构、可调的孔径大小以及可预测的化学功能，使其成为构建各种生物传感系统的理想材料。此外，MOFs可作为贵金属纳米粒子的稳定基底，对这些纳米粒子的修饰可赋予MOF材料独特的光学、物理和化学性质。因此，这些多功能复合材料提供了一个有效且多用途的平台，用于构建双模态传感策略，如电化学发光与荧光（ECL-FL）、荧光与表面增强拉曼光谱（FL-SERS）、荧光与色度（FL-CL）以及电化学色度（EC-CL）。

 本研究将铂（Pt）纳米颗粒引入到Zr-Fe双金属金属有机框架中，以制备具有增强功能（Pt@MOF）的纳米酶。Pt@MOF催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的比色反应，用于比色分析。此外，在MOF形成过程中，中心金属离子与有机荧光配体之间发生配体-金属电荷转移（LMCT），导致有机配体荧光淬灭。研究表明，碱诱导去质子化反应可导致MOF迅速分解，从而恢复配体的荧光特性。基于此，通过Pt@MOF实现双重荧光-比色信号独立输出（图1）。研究表明，Zr-MOF可以通过末端磷酸修饰的寡核苷酸以端对端的方式与Zr-MOF偶联，并已成功应用于传感检测。在检测系统中（图1），采用类似免疫测定格式的磁珠-DNA-Pt@MOF（MB-DNA-MOF，MDM探针）的组合。在此背景下，MB-DNA作为CRISPR反应的底物。反应完成后，引入MOF组装MDM探针。存在目标时，MB-DNA被激活，由Cas12a进行转切割，导致MDM探针失效和双重模式信号的关闭。不存在目标时，Cas12a活性保持潜伏，导致MDM探针成功和双重模式信号的激活。作为概念验证，此反应系统被用于人类诺如病毒的快速定性分析。

图1 基于Pt@MOF的CRISPR介导的双重模式分析机制。合成：通过对比分析采用包封策略获得Pt@MOF。检测：展示基于CRISPR-Cas反应与Pt@MOF连接的免疫分析类似实验的结合。分析：基于TMB颜色发展和通过NaOH切割的荧光检测的视觉分析。

首先，进行ZrFe-MOF的合成、改性及其表征。基于前期研究，采用ZrCl4和FeCl₃⋅6H2O作为金属前驱体，H₂BDC-NH₂作为有机配体，通过溶剂热法实现了ZrFe-MOF的一步合成。扫描电子显微镜（SEM）证实成功合成了具有典型规则八面体结构的ZrFe-MOF（图2A）。X射线光电子能谱（XPS）清晰地表征了该MOF材料的元素组成（C、N、O、Fe和Zr）及其价态分布（图2B）。用Pt纳米颗粒（Pt NPs）如图2D所示，Pt NPs在MOF材料表面原位生长，这是由于MOF骨架对四氯铂酸（IV）前驱体的电子吸引作用，随后用硼氢化钠还原所致。图2E表明大量Pt NPs均匀且致密地吸附在MOF表面，而图2F显示Pt纳米簇在MOF材料内部均匀分散并被封装。总体而言，TEM结果表明Pt NPs的修饰并未破坏MOF的结晶结构。傅里叶变换红外光谱（FTIR）被用于分析所得材料和H2BDC-NH2有机配体（图2C）。红外光谱中1670 cm⁻¹处的吸收峰归因于有机配体的C=O基团，而768 cm⁻¹、664 cm⁻¹和482 cm⁻¹处的峰可归属于锆金属有机骨架中的Zr-O-Zr键。特征吸收带567 cm−1归因于铁基金属有机骨架（ZrFe-MOFs）中的Fe-O-Fe键，表明ZrFe-MOF成功合成。

图2 合成、修饰与表征锆铁金属有机骨架。(A)锆铁金属有机骨架的扫描电子显微镜图像。(B)锆铁金属有机骨架的XPS谱图，包括C 1s、O 1s、N 1s、Zr 3d和Fe 2p区域。(C)Pt/MOF、Pt-MOF、Pt@MOF、ZrFe-MOF和H2BDC-NH2的FTIR光谱。透射电子显微镜图像(D–F)分别展示了Pt/MOF、Pt-MOF和Pt@MOF，其标尺分别为50nm、20nm和50nm。

 研究人员继续验证Pt@MOF基CRISPR双模态分析的可行性。streptavidin磁珠特异性结合5′生物素标记的DNA，并通过3′磷酸基团稳定地与MOF结合（MB-DNA-MOF, MDM）。使用活化的Cas12a切割MB-DNA，随后进行MOF连接。如图3A所示，与未切割的对照相比，吸光度显著降低。所有其他对照组显示出较低的背景值，特别是MB与MOF的孵育，表明MB与MOF之间的连接是DNA介导的。为了验证MDM探针的信号输出能力，对不同浓度的MDM探针进行了TMB测试。结果表明，吸光度与探针浓度之间存在明显的线性关系（图3B）。NH2-BDC配体具有优越的荧光特性；-NH2基团作为电子供体，提供氮上的孤对电子，与苯环的π电子系统相互作用，导致NH2-BDC荧光的红移并增强荧光发射。加入NaOH引起MOF的去质子化，释放荧光配体并增强荧光信号（图3C）。不同浓度磁探针加入NaOH后获得的荧光光谱显示，荧光强度与探针浓度之间存在明显的线性关系（图3D）。

图3 验证CRISPR介导的双模式分析Pt@MOF的可行性。(A) CRISPR介导的比色分析的可行性验证，Aλ = 652 nm。(B) MDM探针在不同浓度(0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/ml)下的吸光度测试。(C) CRISPR介导的荧光分析的可行性验证，在向1 mg/ml Pt@MOF中加入NaOH后产生显著的荧光信号。(D) NaOH降解条件下MDM探针在不同浓度(0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/ml)下的荧光测试，激发波长365 nm，发射波长445 nm。

 接下来进行传感平台构建。Cas蛋白在检测过程中的识别和信号传导中发挥着至关重要的作用。对0.25 nM的激活Cas12a进行了动力学分析，测量了LbCas12a在FQ浓度从15.625到1000 nM范围内的跨切割。将反应前60秒的初始反应速率拟合到米氏-门腾动力学，以报告浓度（图4A）为准。此外，反应曲线表明，FQ浓度越高，达到平台期所需的时间越长。当双链DNA为变量时，双链DNA浓度越高，达到平台期所需的时间越短。通常，为了实现较低的检测限，需要较长的反应时间来积累足够的荧光信号。在crRNA:Cas12a:FQ的比例为62.5:50:500 nM的条件下，比较了3分钟和10分钟反应时间的检测性能。如图4B所示，在3分钟反应后，仅在较高浓度范围内观察到线性响应。然而，将反应时间延长至10分钟，扩大了线性范围，特别是在低浓度范围内。随后，通过用MB-DNA替换底物FQ，并使用不同浓度的靶激活CRISPR/Cas12a进行10分钟切割，证明了MDM探针的信号输出能力。

在添加MOF进行结合和磁分离后，进行了TMB反应或NaOH去质子化。在颜色测定/荧光测定模式下，652/445 nm处的吸光度/荧光值随着双链DNA浓度的增加而降低，表现出良好的相关性（图4C-D）。

图4 构建感应平台。（A）CRISPR-Cas12a转裂解反应过程曲线（1）和米歇利斯-门坦动力学分析（B）。在3 min（1）和10 min（2）反应中，目标浓度相同的CRISPR性能。CRISPR介导的荧光（D）和分光光度法分析（D）。所有数据均为三次平行测量的平均值±标准偏差。

研究人员从NCBI网站下载了GII病毒的12种不同基因型的完整基因组序列，并使用MEGA11进行了序列对齐分析。如图5A所示，即使在诺如病毒的保守区域中，不同基因型之间也存在多样性，这反映了诺如病毒的高遗传多样性。如图5B所示，将PAM位点的T碱基突变至C后，除CCTA和CCTC外，所有非经典PAM均保持了超过64%的跨链切割活性。观察到当PAM中确保两个T碱基时，跨链切割活性受影响最小，该结果进一步通过后续VTTV实验得到验证（图5C）。此外，研究人员还注意到图5A中PAM识别位点邻近靶序列第十五位存在突变。因此，评估了1至20位单碱基及双碱基突变对跨链切割活性的影响（图5D–E）。2、5、12、13、2–3及17–18位的错配使跨链切割活性率降低至一半或更低；13–14位的错配导致Cas12a失活。这些结果表明设计的CRISPR系统具有可行性。通过一管RT-RPA/CRISPR检测验证了crRNA的可行性及RPA引物的特异性，并通过与星状病毒、轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒进行测试以验证其特异性。实时荧光分析显示，仅在存在GII型诺如病毒时出现强显著性荧光信号，归因于扩增产物形成和CRISPR激活（图5F）。使用不同浓度的GII型诺如病毒标准品（1、10、100、1000、10000），RT-RPA/CRISPR双模态分析在荧光和比色模式下均实现了10 copies/μl的检测限。

图5 针对诺如病毒检测的设计与应用。(A) 对来自12种不同基因型的GII病毒基因组序列进行比较分析，以及使用RPA引物。非经典PAMs CTTV、TCTV、TTCV (B) 和 VTTV (C) 的转切活性。转切活性测试：单碱基突变 (D) 和双碱基突变 (E)。 (F) 一管式RT-RPA/CRISPR 实验。所有数据均为三次平行测量的均值 ± 标准偏差。

贝类被认为是人类诺如病毒（hNoV）环境传播的重要载体，也是食物源性hNoV暴发的主要来源。为了验证所开发方法的实用性，使用牡蛎和扇贝进行了实际样本分析和添加样本测试。最初，实时定量PCR和所开发的方法均未检测到病毒的存在。随后，对添加最低感染剂量为18拷贝/μl样本进行了定性分析。此外，为了减少对大型设备的依赖，开发了一种新型多通道荧光分析仪，专门用于荧光模式（365 nm/480 nm激发）检测（图6A）。通过加权最小二乘法为这两个特征统计量分配权重，计算仪器的最终测量结果。该设备旨在提供更紧凑、成本效益更高的解决方案，同时保持荧光分析的准确性和可靠性。在14个并行测试中，实时定量PCR方法的平均Ct值为33.5087，最强烈的阳性信号在40个周期后检测到（图6B），检测时间为1小时。相比之下，本方法在36分钟内即可获得视觉结果和荧光读数（图6C）。与之相比，所开发的方法能在较短的时间内有效进行定性分析。

图6 分析脉冲测试。（A）多通道荧光分析仪及其软件分析界面的示意图。RT-qPCR的脉冲测试（B），以及基于所开发方法进行的视觉分析（C）。十二个样本被独立进行测试实验。

综上所述，本研究成功开发并验证了一种基于Pt@MOF的CRISPR介导的双模态分析方法，该方法利用Pt的优异过氧化物酶样活性和MOF固有的荧光配体来实现双荧光比色读数。该系统的功能依赖于由目标识别触发的转切活性以及随后的CRISPR-Cas12a激活。将RPA扩增与CRISPR分析相结合，以实现对诺如病毒的灵敏、快速和特异性定性分析。该策略支持通过肉眼观察和简单的荧光成像进行定性分析。独立的双模态检测提供了对不同检测条件的灵活性，允许两种模式之间的交叉验证，从而提高了目标检测的可靠性和准确性。总之，本研究展示了一种结合先进纳米材料和分子生物学的创新病毒检测平台，为快速、灵敏和特异的病毒检测提供了新的可能性。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117153