抗菌药物耐药性已成为全球公共卫生的紧迫问题，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）作为革兰氏阳性菌，对常用抗生素具有耐药性，可引发从皮肤感染到危及生命的肺炎、菌血症等严重疾病。MRSA最初于1961年在医疗环境中被发现，但近年来社区获得性和食品污染案例频发，尤其常见于鲜奶和生肉中，对食品安全构成重大威胁。早期诊断MRSA对控制感染至关重要，但传统方法如微生物培养耗时24-48小时，免疫分析法检测PBP2a蛋白灵敏度不足，PCR和qPCR需复杂设备和专业操作，不适用于现场检测。等温扩增技术（如LAMP）虽简化了流程，但通常仅针对单基因，难以实现多重检测。CRISPR/Cas系统虽在核酸检测中展现出优势，但其多重检测仍处于起步阶段，且存在PAM序列依赖和正交Cas蛋白使用的限制。相比之下，原核Argonaute（如PfAgo）具有程序化、序列特异性识别和切割能力，无需PAM依赖，且通过两步切割机制（“双验证”）确保准确性，更适合多重检测。然而，现有Argonaute应用多集中于病毒检测，在细菌检测中尚未见报道。本研究旨在开发一种基于Argonaute的便携式平台（STAR），实现MRSA的双基因同步检测，填补技术空白，并为资源有限地区提供现场检测解决方案。

 研究内容

图1.STAR平台检测MRSA的可行性。

通过实验验证STAR平台的可行性。设计针对nuc和mecA基因的引导DNA序列，并验证PfAgo的纯化活性和切割特异性（图S1-S2）。检测四类样本（阴性对照、nuc基因扩增产物、mecA基因扩增产物及双基因扩增产物），结果显示：阴性样本荧光信号微弱；单基因样本仅对应通道（ROX或FAM）信号增强；双基因样本则两通道信号均显著提升（图1B）。3D打印设备捕获的荧光图像（图1C）与信号值高度一致，RGB分析模型能清晰区分样本类型（图1D）。电泳分析进一步证实PfAgo在具备全部组件（目标DNA、报告探针和引导DNA）时方可激活切割（图1E-F），验证了平台的工作机制。

图2.STAR反应条件优化及3d打印现场检测装置设计。

对PfAgo切割反应条件进行系统优化以提升性能。确定最佳参数为：PfAgo浓度6μM、引导DNA浓度0.5μM、Mn²⁺浓度0.5mM、反应时间15分钟、温度95℃（图2A-C，图S4）。高温确保LAMP产物变性为单链，便于gDNA识别。同时，开发便携式3D打印设备，集成加热模块（提供恒温）、紫外激发光源和滤光片，可通过智能手机App捕获并分析荧光信号（图2D-E）。该设备成本低（122.3美元/台），单次检测成本仅0.806美元（表S5-S6），具备现场应用潜力。

图3.STAR平台检测MRSA的性能

评估STAR平台的检测性能。对金黄色葡萄球菌、MRSA及其他菌株的检测显示，在10-10^7CFU/mL范围内荧光信号与浓度线性相关（图3A-F），检测限低至10CFU/mL（图3H）。选择性实验表明，平台对农杆菌、乳酸菌等干扰物无交叉反应（图3I）。双盲试验中，STAR对24例临床样本的检测准确率高达95.83%（mecA）和100%（nuc），ROC曲线下面积（AUC）接近1.0，优于qPCR（图3J-L）。重复性和重现性测试的RSD值<8%，符合生物传感器标准（图S11）。

图4.应用STAR检测鸡蛋、牛奶和肉类中的MRSA。

在实际样本中验证STAR的应用价值。对鸡蛋、牛奶和肉类等易污染食品的检测显示，加标MRSA后荧光信号显著增强，检测限达10CFU/mL（图4A-F）。动物模型中，口服MRSA的小鼠粪便及组织（肝、脾、肺、肾）检测信号在4小时达峰值，12小时后因免疫反应略有下降，组织病理学证实感染组出现炎症细胞浸润和肠绒毛缩短（图5A-G）。平台在复杂基质中表现稳健，为食品安全和临床监测提供可靠工具。

本研究成功开发了基于Argonaute的STAR平台，首次实现MRSA的双基因同步检测。平台利用PfAgo的程序化切割能力和LAMP等温扩增，在65分钟内达到10CFU/mL的检测限，动态范围覆盖10-10^7CFU/mL。通过“双验证”机制确保高特异性，对临床样本、污染食品和感染动物的检测准确率超95%，优于qPCR。便携式3D打印设备集成反应和可视化功能，成本低廉，适用于资源有限地区。STAR平台克服了CRISPR-Dx在多重检测中的局限性，无需正交蛋白或PAM序列，为病原体现场检测提供了新范式。未来可扩展至其他细菌或病毒的多重检测，在食品安全、临床诊断和公共卫生监测中具有广阔应用前景。

原文链接：https://doi.org/10.1002/smll.202311764