单核苷酸多态性（SNP）广泛存在于基因组中，是解析复杂疾病易感性和个体化用药反应的重要遗传基础。FTO基因rs9939609被大量研究反复证实与肥胖、2型糖尿病、多囊卵巢综合征等多种代谢相关表型显著相关，是代谢领域中极具代表性的风险位点。然而，该位点属于IV类突变（T/A转换），碱基改变引起的熔解温度（Tm）差异小于0.5 ℃，使得传统Sanger测序和常规高分辨率熔解（HRM）在分型时容易出现灵敏度不足、判读不稳的问题。对于缺乏高端平台、又需要承担大样本流行病学研究或临床筛查任务的基层实验室而言，如何在有限预算内选到“好用又用得起”的分型技术，成为一个兼具实践紧迫性与方法学价值的关键问题。

在此背景下，作者刻意选取rs9939609作为“高难度靶标”，并列构建了五种技术路线：四引物等位基因特异性扩增（ARMS-PCR）、基于引入限制性内切酶识别位点的PIRA-PCR、TaqMan探针实时荧光定量PCR、竞争性等位特异错配分析结合高分辨率熔解曲线的CADMA-HRM，以及采用回折引物设计的Snapback-HRM（表1）。以Sanger测序作为金标准，五种方法在同一批样本上进行头对头比较。图1直观展示了各技术在rs9939609位点上的典型输出形式：从测序色谱图中TT/AT/AA三种基因型的峰形差异，到ARMS和PIRA在凝胶电泳上呈现的条带组合，再到TaqMan的等位基因散点聚类，以及CADMA-HRM和Snapback-HRM中熔解峰位置与峰形的细微变化，清楚地表明在精心设计和优化条件下，这些方法均可在Tm差异极小的前提下实现稳定分型。进一步地，表1和表2从引物/探针构型、扩增片段长度、预期熔解区域、设备与试剂需求、总耗时等多维度拆解了这种“图像差异”背后的分子机制与现实代价：ARMS和PIRA依靠条带模式判读，设备门槛最低，但在灵敏度、操作复杂度和通量方面各有短板；TaqMan几乎可视作“准金标准”，却受制于昂贵探针和专用试剂；Snapback HRM在分辨能力上表现突出，但体系极为敏感，优化周期长，更适合作为方法学工具。

综合准确性、成本和操作性各方面证据，作者指出，在具备实时荧光PCR平台、但经费和试剂获取受限的现实情境下，CADMA-HRM通过错配引物竞争扩增有效放大Tm差异，在不依赖昂贵探针的前提下，分型性能接近TaqMan和测序，又保持了与常规HRM相近的试剂成本和周转时间，是在“成本–灵敏度–操作复杂度”三角中最具平衡优势的方案。换言之，本研究借助一个典型IV类“难检”SNP，把看似零散的五种PCR分型技术放回到真实资源约束下重新审视，最终将“不同类型实验室在不同条件下该如何理性选择SNP分型方法”这一长期被忽视的实践问题，具体化为一套可操作的技术选型框架，为发展中国家和基层实验室在精准医学时代开展高质量基因分型提供了清晰而可推广的路径。

表1  五种PCR分型方法的原理及关键设计差异

图1  不同基因分型方法对FTO基因rs9939609位点基因型的可视化结果。（A）Sanger测序色谱图：通过碱基峰形来区分不同基因型——纯合子（TT或AA）表现为单峰，杂合子（AT）在该位点出现双峰。作为后续所有PCR分型方法的“金标准”参考。（B）ARMS-PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳条带：不同基因型对应不同组合的条带（只有公共条带 + T 特异条带 = TT；公共 + A 特异条带 = AA；三条都有 = AT），说明四引物ARMS体系可以通过条带模式进行基因型判读。（C）PIRA-PCR产物的电泳条带：通过酶切前后片段长度的差异（被切/未切片段的组合）来判断样本是TT、AT还是AA，说明这一传统PCR-RFLP方法在该位点同样能实现稳定分型。（D）TaqMan qPCR的等位基因判读散点图：不同基因型的样本在FAM/VIC双通道荧光坐标上形成三个聚类簇，分别对应TT、AT、AA，体现了商业化探针体系在自动判读和聚类清晰度方面的优势。（E）CADMA-HRM的熔解曲线：利用错配引物构建的竞争扩增体系，不同基因型的产物在熔解峰位置和峰形上有明显差异，可通过高分辨率熔解曲线把三种基因型区分开来。（F）Snapback引物HRM的熔解曲线结果：通过带回折序列（发卡结构）的引物，产生特征性低温熔解峰，不同基因型的熔解峰模式不同，同样可以实现rs9939609位点基因型的判读。

表2  五种PCR分型技术在rs9939609检测中的性能与应用条件对比

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2025.343994