食源性病原菌（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌）是全球公共卫生的重大威胁，每年导致约500万人死亡，预计到2035年死亡人数将超过1千万。这些病原菌常共存于食品和复杂环境中，早期检测对预防疫情爆发至关重要。传统检测方法如培养法需24-48小时且操作繁琐；免疫分析法快速但灵敏度低；PCR技术灵敏度高但需核酸提取和扩增，耗时且易污染。多重PCR虽能同步检测多种病原菌，但引物设计复杂、扩增效率不一。近年来，基因编辑工具（如CRISPR/Cas和Argonaute系统）因高特异性、灵敏度和速度备受关注。其中，酪丁酸梭菌Argonaute（CbAgo）能在室温下通过guide DNA（gDNA）介导特异性切割靶DNA，无需预热步骤，但其致密晶体结构限制了灵活性，导致切割活性低，难以检测痕量病原菌。表面增强拉曼光谱（SERS）和深度学习技术虽能提升检测能力，但易受噪声干扰。

本研究创新性集成二维编码聚苯乙烯（PS）微球、四链DNA增强的杂交链式反应（TDNA-HCR）和CbAgo解码系统，构建可编程显微成像平台。TDNA-HCR通过刚性结构固定发夹探针，提升荧光信号强度和稳定性；二维编码通过微球尺寸和荧光颜色实现多重信号输出；CbAgo系统将病原菌信息转化为gDNA信号，触发特异性切割，释放荧光信号；计算机视觉算法自动分析微球颜色、尺寸和数量，实现无需核酸扩增的多重检测。该平台旨在解决现有技术操作复杂、耗时长和灵敏度不足的局限，为食品安全和临床诊断提供高效工具。

研究内容

图1. 使用超亮和二维荧光微球编码和基于cbago的解码系统的可编程显微成像平台的工作流程。

研究首先构建了TDNA增强的二维荧光PS微球编码系统。TDNA通过四条单链自组装形成刚性结构，发夹探针（H1和H2）通过黏性末端杂交连接到TDNA，其中H1标记荧光基团和淬灭基团。PS微球表面通过生物素-链霉亲和素偶联iDNA，引发TDNA-HCR反应：iDNA存在时，发夹探针打开，荧光基团与淬灭基团分离产生信号；无iDNA时，系统保持稳态。琼脂糖凝胶电泳验证TDNA和TDNA-HCR成功合成（条带迁移率变化）。Zeta电位和粒径分析显示PS微球修饰后电位从-25 mV变为-18 mV，粒径从3 μm增至6 μm，表明TDNA-HCR负载。元素分析（C、O、P、Br）和SEM成像证实微球表面成功修饰。荧光显微镜显示PS-TDNA-HCR亮度显著高于传统PS-HCR，荧光强度提升80%，且TDNA-HCR将反应时间从90分钟缩短至30分钟（减少67%），归因于TDNA空间结构促进发夹探针同步打开。稳定性测试表明PS-TDNA-HCR在4°C下可储存42天，而PS-HCR仅7天，因TDNA三维结构保护荧光基团。这些表征验证了编码系统的可靠性和增强性能。

图3. 使用可编程显微镜成像平台检测金黄色葡萄球菌

以金黄色葡萄球菌（S. aureus）为模型，评估平台检测性能。适配体特异性识别病原菌后释放gDNA，激活CbAgo切割iDNA，减少荧光微球数量。采用两种定量策略：荧光强度法（ImageJ分析平均灰度值）和微球计数法（计算机视觉算法自动识别）。结果显-示，S. aureus浓度在10⁰-10⁷ CFU/mL范围内，微球计数法线性关系更优（y=43.70x-13.40, R²=0.956），检测限（LOD）为20 CFU/mL（信噪比S/N=3）；荧光强度法LOD为53 CFU/mL（y=5.74x-11.82, R²=0.960）。微球计数法通过二值化过滤背景噪声，精准统计微球连接域，提升稳定性。特异性测试中，仅S. aureus引起微球数显著变化，大肠杆菌、沙门氏菌等干扰可忽略。平台使用直径2 mm的PS微球载体，通过移液器实现相分离，简化复杂样本处理。与传统平板计数法（24-48小时）相比，检测时间缩短至1.5小时，且无需核酸提取。

图4. 多重检测金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和单核细胞增多性利斯特菌。

平台扩展至四种病原菌（S. aureus、S. Typhimurium、E. coli、L. monocytogenes）的多重检测。通过二维编码：微球尺寸（3 μm和6 μm）和荧光颜色（不同荧光标记）组合创建信号库，每种病原菌对应特定编码探针。适配体将病原菌信号转化为gDNA，激活CbAgo特异性解码。结果显示，随病原菌浓度增加（10³-10⁷ CFU/mL），对应编码微球数量线性减少：S. aureus（y=13.71x+31.80, R²=0.984）、S. Typhimurium（y=13.66x-0.41, R²=0.989）、E. coli（y=11.02x+30.05, R²=0.987）、L. monocytogenes（y=9.94x+12.02, R²=0.977）。

LOD分别为39 CFU/mL、92 CFU/mL、46 CFU/mL和101 CFU/mL。计算机视觉算法自动分类微球颜色和尺寸，实现同步识别。与热敏Argonaute系统相比，CbAgo室温操作降低环境要求；与CRISPR/Cas9相比，无需PAM序列且gDNA成本低。平台在混合病原菌样本中保持高特异性，无交叉反应。

图5. 可编程显微镜成像平台用于真实样本中4种病原菌的检测。

在10例临床样本（患者）和10例鱼类样本中验证平台性能。平板计数法作为对照：临床样本中3例S. aureus、2例S. Typhimurium、5例E. coli；鱼类样本中3例S. aureus、2例S. Typhimurium、3例E. coli、3例L. monocytogenes。平台检测结果与平板计数高度一致（相关系数>0.98），证实其在复杂基质中的准确性。成本-效率分析显示：平台单次检测成本低于商用试剂盒（如PCR kit 59.8元/次），耗时1.5小时（平板计数需24-48小时），劳动力需求低，且具备多重检测能力。计算机视觉算法实现自动化分析，减少人为误差。平台无需核酸扩增，避免了污染风险，为现场检测提供潜力。未来可通过集成微流控和便携成像设备进一步优化。

本研究成功开发了一种基于二维编码荧光微球和CbAgo解码系统的可编程显微成像平台，实现了对多种食源性病原菌的高灵敏度、多重、无扩增检测。TDNA-HCR技术显著增强荧光信号强度和稳定性，反应时间缩短67%；CbAgo系统通过gDNA介导特异性切割，实现1:n信号放大，检测限低至20 CFU/mL；计算机视觉算法自动分析微球颜色、尺寸和数量，提升检测效率和准确性。在实际样本验证中，平台与平板计数法结果高度一致，且具备成本低、耗时短（1.5小时）、操作简便等优势。与传统方法相比，该平台避免了核酸提取和扩增步骤，降低污染风险，特别适用于食品安全和临床诊断的现场检测。未来工作将聚焦于开发多形状微球以扩展编码维度，集成微流控技术实现便携式设备，并结合深度学习优化算法泛化能力。该技术为病原菌监测提供了创新工具，对公共卫生和食品安全管理具有重要应用价值。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.4c05471