核心提示：常用的Cas蛋白有，Cas9可特异以识别和切割,dCas9虽然不能用于切割但有非常好特异性的结合能力，可作为识别感受器，生成检测信号。

  当下，关于核酸检测的广泛研究致力于采用核酸扩增的方法来富集目标片段，从而提高检测效率。但是，PCR等扩增手段具有产生交叉污染，非目标序列扩增等潜在问题。因此，在不进行核酸扩增的条件下完成检测，实现目标核酸序列的检测具有很大研究意义。

  Crispr/Cas作为一种新兴基因组编辑工具，能够应用于核酸检测过程当中。具体的的作用原理为：入侵物质的部分核酸片段被整合到宿主核酸中，形成互补的crRNA，再次入侵，crRNA结合Cas蛋白，识别对应核酸序列，进行切割或者结合，有些机制发生作用需要识别PAM或者PFS序列。

  常用的Cas蛋白有，Cas9可特异以识别和切割,dCas9虽然不能用于切割但有非常好特异性的结合能力，可作为识别感受器，生成检测信号。Cas12a可作用于dsDNA和ssDNA进行非特异性切割。Cas13a可以非特异性切割RNA，Cas14是最小的RNA指导的核酸酶，可以不依赖PAM而非特异性切割ssDNA。基于CRISPR/Cas的无扩增核酸检测依赖于CRISPR/Cas的反式切割，顺式切割以及特异性结合。

  在无扩增核酸检测中，由于不进行靶标的扩增，导致反应体系整体添加量降低，这对试验的特异性和灵敏度的要求会很高，总的来说，现在的常用方法就是通过提高靶标浓度或者扩大信号强度来提高监测体系的特异性和灵敏度,在信号检测这一方面，目前常用方法主要为荧光信号，电化学信号和比色技术。

  关于荧光信号的检测，是利用Cas蛋白的非特异性切割，当Cas蛋白识别靶标，非特异性切割活性激活，在切割靶标的同时，淬灭的荧光探针被切割激活，产生荧光信号。

  关于比色法检测，是利用Cas蛋白的非特异性切割，在切割靶序列的同时，切割被生物素和抗体标记的ssDNA,若不存在靶序列，则ssDNA会与control band上的链霉素结合，产生信号，此时，sample band无信号显示;若存在靶序列，则被切断的ssDNA分为含有生物素的一部分和含有抗体的一部分，含生物素部分结合control band产生信号，含抗体部分结合sample band，产生信号。

  关于电化学信号的检测，是利用Cas蛋白活性激活后，会非特异性切割ssRNA,固定在电极上的ssRNA被切割，电信号发生变化。

  在这种新的检测方法中也存在不少问题，第一个存在的问题是在之前的核酸检测方法中，因为会对目标核酸进行扩增，所以核酸纯度会有所保证，但在无扩增的核酸检测中，如果核酸不进行分离纯化，直接在未处理样品中检测，非靶标的存在就会严重干扰实验结果，并且，如果靶标是RNA片段，那样品中存在的RNA酶的存在就会降解RNA，干扰Cas蛋白的结合和切割，影响实验结果。所以，样品的纯化处理就非常重要。第二个存在的问题是一些Cas蛋白需要识别PAM，所以离PAM远的一些位点就不容易识别。第三个问题是关于结果的量化，由于反应体系样品量较少，想要精确定目标物质含量，就需要对试验设备以及试验方法有很高的要求，随着微室的应用，可以实现靶标的单分子检测，从而对靶标进行定量，但是微室的制造又很复杂。第四个问题是，在多样品混合物中，由于CRISPRCrispr/Cas的无差别切割，会导致一些非靶标物质被切割，产生假阳性，分离耗费又很大。

  有一些CRISPR/Cas技术用于非核酸检测中，具体方法是先制备功能DNA ,该DNA包含适配子和激活子两部分，在没有遇到靶标的情况下，激活子没有活性，当适配子与靶标结合，激活子被释放，具备活性，后生成对应ssDNA，并与Cas蛋白，crRNA相结合，释放信号。如果产生信号的功能DNA量较少，是否可以通过确定功能DNA的初始添加量以及剩余量，推出靶标含量，实现靶标定量。关于靶标结合问题，能否根据结合强度设计合适适配体，确保特异性;为防止Cas蛋白的非特异性切割，能否事先将功能DNA的激活子Cas蛋白以及聚合酶进行包裹，当接触靶标后，ssRNA边生成边与Cas蛋白结合产生信号，减少假阳性。