食品及环境中食源性病毒的非特异性富集方法

食源性病毒（如人类诺如病毒HuNoV、甲型肝炎病毒HAV、轮状病毒RVA）是全球食源性疾病的主要病原体。这些病毒具有极强的环境抗性，可在食品表面、水源及环境中长期存活，且感染剂量极低，例如HuNoV仅需18–100个病毒颗粒即可致病。然而，病毒在食品及环境样本中浓度通常极低，且复杂基质（如贝类、绿叶蔬菜）常含有抑制分子检测的干扰物。因此，高效的病毒浓缩技术成为检测的关键。

非特异性病毒浓缩技术（图1）是利用病毒颗粒的理化特性（如尺寸、表面电荷），适用于多种病毒类型，其缺点是可能将干扰物质一起浓缩。

图1 非特异性富集方法介绍 a PEG沉淀；b 超速离心法；c 超滤法；d 吸附洗脱法

聚乙二醇（PEG）沉淀法

该方法是一种成熟的浓缩方法，PEG是一种高分子聚合物，将溶剂捕获在PEG聚合物结构中，从而增加悬浮目标的相对浓度，直到达到临界水平并从悬浮液中沉淀出来。PEG的浓度（6%-16%）和分子量（6000-20000）根据样本类型调整。由于其非特异性，它倾向于共浓缩非靶蛋白和其他可能对下游检测有抑制作用的分子，并且根据所涉及的基质，其回收率表现出显著的可变性（5%-90%）。例如，在贝类样本中，PEG的回收率不一致，而在绿叶蔬菜中效果不如其他方法。因此，该方法通常不用做一个独立的方法，而是与其他方法一起配合使用。

超速离心法

利用超高速离心分离病毒颗粒，该方法目前主要用于废水中病毒浓缩，但其样本通量低，需专用转子，前期设备投资高。并且在食品基质中表现不稳定。例如，应用该方法富集火腿中HuNoV GII.4，回收率为70%，而在覆盆子中仅为4%。

超滤法

超滤使用配备有膜孔的过滤器，这些过滤器可以允许比其孔径低分子量的颗粒和液体通过。病毒颗粒通常被捕获在膜上，并且可以在后续步骤中洗脱。该方法的主要优点之一是，可以处理更大的样品量，同时有助于去除潜在的PCR抑制剂。当使用下游分子方法进行病毒检测时，这一点非常重要。与 PEG 沉淀或超速离心相比，它通常也更快速且需要的步骤更少，使用超滤进行浓缩的一个主要缺点是用于该程序的过滤器可能会结垢，尽管在处理水样或绿叶蔬菜时，超滤可能是一种相当快速有效的浓缩方法，但它可能不太适用于其他食品基质。

吸附/洗脱技术

①     带电滤膜法

带正电的滤膜似乎是捕获和浓缩带负电病毒颗粒的自然选择。例如，一种阳离子涂层滤膜法使用的是商业化的带负电纤维素滤膜，涂有氯化铝（Al³⁺），随后通过冲洗步骤去除铝离子，并在1 mM NaOH中洗脱病毒颗粒。滤液经过离心后，最终的上清液用于PCR检测特定病毒。尽管该方法广泛使用，但商业阳离子滤膜价格昂贵，可能限制了其应用。

另一种吸附浓缩方法是使用带负电的滤膜。这些滤膜最初用于从河水和其他水源中浓缩病毒颗粒。带负电滤膜的病毒回收率与带正电滤膜相当，具体取决于目标结合物和洗脱方法。尽管带负电滤膜不像带正电滤膜那样涂有阳离子，但添加多价阳离子可以增强病毒吸附。将悬浮液的pH值降低至约3.5（或低于非包膜病毒衣壳蛋白的等电点）是确保病毒与带负电滤膜结合的另一种方法，这种方法已在一些研究中用于食品样本。

②     玻璃纤维/粉末吸附

玻璃纤维吸附是将玻璃棉以适当的密度填充到柱子中，然后让样品流过吸附柱。病毒颗粒就会被吸附在玻璃棉过滤基质上，可以通过提高pH值进行洗脱。玻璃棉过滤柱价格低廉，特别适用于现场使用。主要应用于水质分析，且能够处理大量样品。该方法还存在一些缺点。尽管该方法不需要对样品进行预处理，但仍需用盐酸、水、氢氧化钠对柱子进行预洗，最后再用水冲洗至中性。在处理非常大体积样品时，还可能需要进行二次浓缩步骤。

玻璃粉末吸附法在原理上与玻璃棉过滤相似，但使用的过滤基质为玻璃珠而不是玻璃纤维，可防止堵塞。然而，最近很少有研究使用这种方法进行水质分析。这可能是因为使用玻璃粉浓缩的设备非常复杂，并且需要大量的样品预处理。

非特异性病毒浓缩方法在食源性病毒检测中发挥了重要作用，其通用性和低成本使其成为实验室和现场操作的常用技术。然而，这些方法的回收率和抑制物去除能力受基质影响较大，且操作复杂性和时间成本较高。未来，随着新型材料（如离子液体和磁性纳米颗粒）的开发和多技术联用策略的应用，非特异性浓缩方法的效率和稳定性有望进一步提升。

       参考文献：

       Stoufer S, Soorneedi AR, Kim M, Moore MD. Sample Processing and Concentration Methods for Viruses from Foods and the Environment Prior to Detection. Annu Rev Food Sci Technol. 2024, 15(1):455-472.