铜绿假单胞菌是一种具有高度抗生素耐药性和强毒力的病原体，常引发院内感染，导致显著的发病率和死亡率。它与多种感染相关，包括呼吸道感染（如囊性纤维化和呼吸机相关性肺炎）、血流感染和泌尿道感染等。近年来，铜绿假单胞菌的多重耐药和广泛耐药菌株的全球传播，使其成为世界卫生组织（WHO）2024年细菌优先病原体名单中的高危病原体，治疗难度极大。传统的细菌检测方法依赖于培养，通常需要48至72小时才能得出结论，这与快速检测铜绿假单胞菌的需求不符。近年来，尽管基于核酸识别或免疫检测的新方法不断涌现，但这些技术存在一些局限性，如无法区分死菌和活菌、可能出现假阳性和假阴性结果、成本高以及需要专业技术人员操作，这在资源有限的地区实施起来尤为困难。因此，开发一种快速、准确、简单且低成本的铜绿假单胞菌检测方法显得尤为迫切。噬菌体（phages）是专门感染细菌的病毒，其对宿主细菌的高度特异性使其成为开发快速、高选择性诊断工具的理想选择，有望填补速度与精度之间的空白，为诊断创新提供新的途径。

基于此背景，Sílvio B. Santos等人提出利用噬菌体的宿主特异性与基因工程技术，构建了携带NLuc荧光素酶基因的工程报告噬菌体，以实现对铜绿假单胞菌的快速精准检测，其核心机制如图1所示。该团队选择此前已鉴定的铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeP_PE3（简称PE3）为基础，借助酵母介导的噬菌体工程平台，将NLuc基因插入噬菌体基因组中，替换PE3Δgp1–gp12骨架上一个假设非必需基因gp53。该工程噬菌体被命名为PE3:KO3:NLuc，其中KO3代表缺失gp1–gp12的改造背景。这种改造不仅没有削弱噬菌体的感染能力，反而使其潜伏期缩短、爆发量增加，从而增强了复制效率。该噬菌体感染铜绿假单胞菌后，会将携带NLuc基因的DNA注入宿主细胞，在噬菌体内源启动子的驱动下表达NLuc荧光素酶。随着噬菌体完成复制并裂解宿主，释放出子代噬菌体与积累的NLuc蛋白，随后在荧光素酶底物作用下产生发光信号，信号强度与细菌数量正相关，从而实现定性和定量检测。

在实验过程中，研究人员对工程噬菌体PE3:KO3:NLuc的检测性能进行了系统评估。他们将不同浓度的铜绿假单胞菌PAO1与噬菌体共孵育，在不同时间点测量发光信号。结果显示，在3小时内，噬菌体能够检测到浓度为4×10⁵CFU/mL及以上的细菌（图2）。结合离心浓缩的样本前处理，在7小时的孵育时间内，检测限可降至10²CFU/mL的活菌；24小时则可检测低于1 CFU/mL（图3）。为验证特异性，研究人员测试了临床相关的铜绿假单胞菌及多种非目标菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌等），结果显示该噬菌体仅对铜绿假单胞菌产生信号。进一步检测表明，在7小时内，不同铜绿假单胞菌株的检测限为10³ CFU/mL，在24小时内均可降至1 CFU/mL以下（图4）。研究团队还将铜绿假单胞菌人工接种至马血中，模拟血流感染。结果显示，该方法在血液中7小时可检测到约9×10² CFU/mL的细菌，24小时的检测限为约9 CFU/mL（图5）.

总之，本研究开发了一种基于基因工程噬菌体的铜绿假单胞菌检测方法。其特点在于：插入NLuc基因不仅保留了噬菌体的感染能力，还提高了复制效率，从而增强检测信号；该方法快速、高灵敏且特异性强，能在复杂样本（如血液）中应用。然而，该方法在7小时检测窗口内对不同临床株的灵敏度存在差异，这提示在应用中仍需优化条件以提高普适性。此外，推广还需考虑检测成本与操作简便性。总体而言，该研究为铜绿假单胞菌的快速诊断提供了一种新技术思路，具备进一步开发为床旁检测工具的潜力。

图1  基于工程噬菌体的铜绿假单胞菌检测方法示意图。

图2  工程噬菌体PE3:KO3:NLuc在3小时内检测不同浓度（4E+1到4E+6 CFU/mL）PAO1菌株的发光信号变化图。

图3  工程噬菌体 PE3:KO3:NLuc在7小时内检测不同浓度（5E+0到5E+4 CFU/mL）铜绿假单胞菌（PAO1）的发光信号变化图。

图4  不同细菌（目标与非目标）的检测：24小时时间框架内的发光信号。（i）目标菌株板块（阳性组），测试多株临床铜绿假单胞菌（Pa5、Pa6、Pa21、Pa A65），结果显示7小时可检测到10³ CFU/mL，24小时可检测到低于1 CFU/mL，仅不同菌株7小时检测下限因噬菌体感染效率差异略有不同。（ii）非目标菌株板块（阴性组），测试ESKAPE耐药菌组成员（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌），结果显示所有非目标菌株即使高浓度孵育，RLU值仍接近基线，无阳性信号。为清晰呈现核心结论，靶标菌株板块省略10⁴ CFU/mL以上高浓度数据，非靶标菌株板块省略10⁶ CFU/mL以下低浓度数据。

图5  人工污染血液样本中PAO1的检测。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117907