铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性机会性病原体，常在免疫受损个体中引发严重感染，如医院获得性肺炎和泌尿道感染等。其广泛存在于自然和人工环境中，可通过空气、水和土壤传播，对公共卫生构成威胁。因此，快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌对于相关疾病的早期诊断和治疗至关重要。传统检测方法如平板计数法耗时且缺乏特异性，而PCR和质谱分析等替代技术则需要昂贵设备和专业人员。电化学生物传感器因其高灵敏度、操作简便、快速响应和低成本等优势，在病原体检测领域受到广泛关注。其中，凝集素因其独特的糖结合特异性而成为极具潜力的识别元件。LecB是一种由铜绿假单胞菌分泌的可溶性凝集素，能够特异性结合果糖、甘露糖及其含甘露糖的寡糖。研究表明，LecB与铜绿假单胞菌细胞表面的Psl多糖相互作用，促进生物膜的稳定性。基于此背景，山东大学王霞课题组利用重组LecB的高特异性结合能力，并结合纳米多孔金（NPG）作为固定载体，构建了一种新型阻抗电化学生物传感器。

该传感器的工作原理可以概括为：铜绿假单胞菌细胞表面的Psl多糖中的α-D-甘露糖残基与LecB蛋白发生特异性结合。将LecB固定在NPG上，并进一步修饰到GCE电极上。当样本中存在铜绿假单胞菌时，会与LecB/NPG/GCE结合形成一层非导电复合物，阻碍电子的转移，导致电极表面的电荷转移阻抗（Rct）显著增加（图1）。这种阻抗的变化可以通过电化学阻抗谱（EIS）进行检测（图2）。检测结果显示（图3），其电荷转移阻抗（Rct）随细菌浓度的对数线性增加，检测范围为10 CFU/mL至10⁶ CFU/mL，检测限低至10 CFU/mL，且相关系数（R²）达到0.994，表现出优异的定量检测能力。在特异性测试中，非目标细菌对检测信号的影响较小，相对变化在5.95%以内，证明了其对铜绿假单胞菌的特异性识别能力。重复性测试中，五次独立实验的相对标准偏差（RSD）小于6%，表明生物传感器具有良好的重复性，能够在多次检测中提供一致的结果。在实际应用验证中，研究人员在自来水、牛奶和人血清等复杂样本中进行了加标实验，回收率为93.05%至119.63%，相对标准偏差低于7.85%，进一步证明了其在复杂环境下的适应性和可靠性（表1）。

总体而言，本研究开发的基于重组LecB蛋白和纳米多孔金的阻抗生物传感器，实现了对铜绿假单胞菌的快速、灵敏检测。该传感器具有高特异性、宽检测范围和低检测限，适用于多种复杂样品。其优势在于检测灵敏、速度快、成本效益高且易于制备，显示出良好的现场应用前景。但在处理极高浓度样本时仍存在一定的非特异性吸附效应，且长期稳定性和规模化应用的可行性仍需进一步研究。

图1  LecB/NPG/GCE生物传感器的构建过程及铜绿假单胞菌检测原理。

图2  LecB/NPG/GCE生物传感器的制备和电化学性能表征。（A）NPG的SEM图像，展示了其三维多孔结构，为生物分子的固定提供了丰富的结合位点。（B）LecB/NPG复合材料的SEM图像，显示LecB蛋白成功固定在NPG表面，多孔结构变得不明显。（C）NPG的EDS分析，检测到主要含有金（Au）元素，表明NPG的纯度较高。（D）LecB/NPG复合材料的EDS分析，检测到碳（C）、氮（N）和氧（O）元素，进一步验证LecB蛋白成功固定在NPG表面。（E）CV测试结果，显示NPG/GCE电极的氧化还原峰电流密度显著高于裸GCE，而LecB/NPG/GCE电极的氧化还原峰电流密度显著降低，表明LecB蛋白成功固定并影响了电极的电化学性能。（F）EIS测试结果，显示LecB/NPG/GCE电极的电荷转移阻抗（Rct）显著增加，表明LecB蛋白的固定形成了绝缘层，阻碍了电子转移。

图3  LecB/NPG/GCE生物传感器对铜绿假单胞菌的检测性能。（A）LecB/NPG/GCE生物传感器对铜绿假单胞菌的检测可行性。Rct显著增加，表明生物传感器能够特异性识别铜绿假单胞菌。（B）NPG/GCE电极对铜绿假单胞菌的非特异性吸附。低浓度下阻抗变化不明显，高浓度下阻抗变化显著，表明非特异性吸附在高浓度下有一定影响。（C）LecB/NPG/GCE生物传感器对不同浓度铜绿假单胞菌的检测。Rct随浓度对数线性增加，检测范围为10 CFU/mL至10⁶ CFU/mL，检测限低至10 CFU/mL。（D）Rct与铜绿假单胞菌浓度对数之间的线性关系。（E）LecB/NPG/GCE生物传感器的特异性。非目标细菌对检测信号的影响较小，相对变化在5.95%以内，表明生物传感器具有良好的特异性。（F）LecB/NPG/GCE生物传感器的重复性。五次独立实验的RSD小于6%，表明生物传感器具有良好的重复性。

表1  不同样品中铜绿假单胞菌的回收率和相对标准偏差

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117788