基于全基因组分析实现铜绿假单胞菌抗菌药物表型预测

WGS在抗菌药物表型(敏感/耐药)的预测上应用不足。本研究将其作为突破口，基于WGS开发了一个基因型评分系统，以应用于P.ae对5种抗生素：头孢他啶(TAZ)、头孢唑烷-他唑巴坦(TOL/TZ)、美罗培南(MER)、环丙沙星(CIP)和妥布霉素(TOB)的敏感/耐药性预测。定义抗性突变型的一个基本要求是区分耐药(AR)基因中的自然多态性和抗性突变。因而，研究首先利用100株野生型分离株去确定P.ae耐药基因的自然多态性，再应用于204株临床分离株，由此验证评分系统的预测能力。

多重耐药(MDR)或泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P.ae)在医院内引起的感染率和死亡率显著增加，这得益于P.ae具有染色体基因突变产生耐药性以及水平获得耐药性的非凡能力，这样的因素往往与流行的高危克隆有关。全基因组测序(WGS)已被证明可以用于分析P.ae的耐药性机制，包括突变抗性和水平获得性抗性。然而，WGS的一个主要潜在用途是抗菌药物敏感/耐药表型的预测，但由于P.ae耐药机制的复杂性，该技术还未能得以充分应用。为了推动这一领域向前发展，Sara Cortes-Lara等人开发了一个耐药基因评分系统，通过分析WGS所得的耐药基因以预测P.ae对5种抗生素的耐药/敏感性，包括TAZ、TOL/TZ、MER、CIP和TOB。所采用的方法基于两个关键里程碑：野生型菌株中染色体抗性基因自然多态性的定义;根据抗性基因在耐药水平上的影响去发展一个加权抗性突变的目录。

研究提出的基因型评分系统设值为0~1，其中，0表示菌株对抗生素敏感，0.5到1(包含0.5)表示菌株对抗生素的低耐药性(仍然定义为敏感株)，大于1(包含1)表示菌株耐药。表型敏感/耐药结果则根据EUCAST标准V9.0折点方法进行判定。工作中，作者首先利用已发表的临床菌株和体外耐药进化实验数据，确定了可能与TAZ、TOL/TZ、MER、CIP和TOB耐药性有关的40个染色体基因(包括固有突变和水平转移)。然后，对来自51家医院的100株野生型菌株进行了全面测序和分析。结果显示，这些野生型分离株具有较高的遗传多样性背景，存在多达81种不同的序列分型(STs)，包括高危克隆ST235、ST244、ST308、ST654(图1)。由此，指出高危克隆菌株的检测可能并不总是与抗菌素耐药性有关。随后，作者对这100株P.ae开展染色体抗性基因的遗传变异分析，结果显示，在确定的40个基因中定义了455个不同的错义突变(P.ae自然多态性目录)。除编码青霉素结合蛋白PBP2的PA4003位点外，所有选定的染色体基因中都出现了自然多态性。自然多态性也很少发生在编码其他青霉素结合蛋白的基因中，如PBP3、PBP4或PBP5。相比之下，一些编码AmpC、MexXY或MexCD-OprJ的基因则呈现出超过25种不同的自然多态性，显示出强大的进化压力(图2)。从野生型分离株的抗性分析中筛选出自然多态性后，作者就利用评分系统计算菌株的基因型得分。如表1所示，有2株分离株被判定为CIP耐药，3-5株显示出对TAZ、MER、CIP或TOB的低水平基因型耐药性。对于CIP的耐药判定，研究人员表示这是由mexS中的一个失活突变所导致，尽管后续RT-PCR未能证明mexS转录增加，但这也表明了基因型和表型耐药性预测之间存在一定的差异。最后，利用来自51家医院的204株P.ae分离株验证该基因型评分方法的预测能力。在这里，研究人员首先表征了这204株验证菌株与100株野生型和参考菌株的克隆相关性及其药物敏感/耐药性，详见图3。随后，作者给出了这204株P.ae的基因型得分和敏感(S)/耐药(R)结果(图4，表2)。研究证明，该评分系统能够有效地实现抗生素敏感性预测，但在耐药性预测上仍然有很大的提升空间。