通过空肠弯曲杆菌的氧化应激增强亚铁和三价铁的生物膜形成

  弯曲杆菌是全球主要的食源性病原体。生物膜形成是维持弯曲杆菌在恶劣胁迫条件下生存能力的重要生存机制。铁会影响其他一些细菌的生物膜形成；然而，铁对弯曲杆菌中生物膜形成的影响尚未得到研究。在这项研究中，作者发现Fe2+和Fe3+铁刺激空肠弯曲杆菌的生物膜形成。用铁螯合剂封存铁阻止了铁介导的生物膜刺激。铁增加了生物膜中总活性氧(ROS)的水平。然而，补充抗氧化剂可防止铁增加生物膜中的总ROS水平，并抑制空肠弯曲杆菌中铁介导的生物膜刺激。这表明铁通过氧化应激促进生物膜的形成。根据荧光显微分析结果，Fe2+和Fe3+增强微菌落形成和生物膜成熟。通过补铁增加生物膜中细胞外DNA和多糖的水平。还研究了铁对生鸡肉中70种空肠弯曲杆菌分离株的生物膜形成的影响。无论生物膜形成的固有水平如何，铁刺激所有测试菌株中的生物膜形成;然而，铁浓度存在影响生物膜形成的应变变化。92.9%(70株中的65株)的生物膜形成通过40μM Fe2+或 20 μM Fe3+能增强生物膜的形成。本研究结果表明，Fe2+和Fe3+通过氧化应激刺激空肠衣原体生物膜的形成。

  铁会影响生物膜的形成：

  为了检查铁对生物被膜形成的影响，生物被膜测定使用微量必需培养基α (MEMα)，不含铁，有/没有铁补充。

  图1 铁对空肠弯曲菌NCTC11168生物膜形成的刺激作用。

  对铁对空肠弯曲菌NCTC11168生物膜形成的刺激作用在一个有代表性的实验中，数据显示了三个样本的均值和标准差。实验重复三次，所有重复实验都得到了相似的结果,铁(Fe2+和Fe3+)可促进空肠弯曲菌生物膜的形成。

  螯合剂和抗氧化剂对铁介导的生物膜促进的抑制作用

  为了确认铁对生物膜刺激的影响，生物膜测定在补充铁螯合剂中进行。铁螯合剂处理生物膜显著抑制了铁介导的空肠弯曲菌生物膜形成的增强(图2A)。铁螯合剂(甲磺酸去铁胺,DFMS)，抗氧化剂NAC

  图2铁、螯合剂和抗氧化剂对空肠弯曲菌 NCTC 11168生物膜形成(a)、ROS产生(B)和细胞内铁(C)水平的影响

  虽然铁是一种必需营养素，但它可以通过Fenton/ Haber-Weiss反应( H2O2在细胞内Fe2+或Cu+的存在下可通过Fenton/ Haber-Weiss反应转变成羟自由基)产生活性氧(ROS) 。因为氧化应激影响空肠弯曲菌的生物膜形成，所以推测铁介导的生物膜促进可能与氧化应激有关。从图2B可知，铁增加总ROS水平，而铁螯合剂和抗氧化剂降低总ROS水平。从图2C可知，细胞内铁含量随着铁的补充而增加，通过铁螯合剂而降低。抗氧化处理抑制了铁介导的生物膜形成，尽管铁和抗氧化处理的生物膜的细胞内铁水平与只处理铁的生物膜相当上述结果表明，铁对空肠弯曲菌生物膜的促进作用与氧化应激有关。

  铁提高EPS的产量

  利用荧光显微镜观察有铁和没有铁时生物膜的形成。补铁显著促进了空肠弯曲菌生物膜形成早期(12 h)微菌落的建立，并在24 h时促进了成熟生物膜结构的发育，提示铁可能影响了空肠弯曲菌生物膜形成的早期和晚期。

  图3(A) Fe2+和(B)Fe3+对空肠弯曲菌 NCTC 11168生物膜形成的促进作用

  从图可知，Fe2+和Fe3+均显著增加了生物膜中eDNA和胞外多糖的产生;然而，铁螯合剂和抗氧化剂降低了空肠弯曲菌的eDNA和胞外多糖水平。这些研究结果表明，铁通过刺激eDNA和胞外多糖的产生，促进了空肠弯曲菌生物膜的形成。

  铁对70株零售生鸡空肠弯曲菌生物膜形成的影响

  从零售生鸡肉中分离出70株空肠弯曲菌，评估了铁对生物膜形成的影响。

  图4 铁(40µM Fe2+和20µM Fe3+)对70株低(A)、中(B)和高(C)水平下可形成生物膜的空肠弯曲菌生物膜形成的影响

  在缺铁条件下，供试菌株的生物被膜形成水平差异显著，从低、中到高，铁明显刺激了供试菌株的生物被膜形成，且存在菌株依赖性变化。70株供试菌株中有51株(72.9%)在40株µM Fe2+和20株µM Fe3+作用下均表现出生物膜的促进作用。

  图5 (A)70株具有不同生物膜形成能力的空肠弯曲菌的MLST克隆复合物(CCs)

  然而，只有40株µM Fe2+或20株µM Fe3+促进了14株(20%)的生物被膜的形成，而两者都没有促进，有5株(7.1%)的生物被膜的形成，40µM Fe2+或20µM Fe3+均没有促进。

  图5B以及40µM Fe2+和/或20µM Fe3+促进生物膜形成的空肠弯曲菌比例

  从图可知，生物膜形成的内在水平与菌株的多位点序列分型(MLST)克隆复合物(CCs)无关。MLST CCs 21和45分布在弱、中、强生物膜造影剂中;然而，较小的MLST CCs，如353、354和362，在强生物膜菌中未发现。不同浓度的Fe2+和Fe3+均能促进所有供试菌株的生物被膜形成，且菌株差异很大。

  图6 (A)40µM Fe2+和20µM Fe3+对细菌生物膜形成均无促进作用，(B)40µM Fe2+对细菌生物膜形成无促进作用，(C) 20µM Fe3+对细菌生物膜形成无促进作用

  这些结果表明，大多数空肠弯曲菌在相似浓度范围内(约40µM Fe2+和20µM Fe3+)都能促进生物被膜形成。然而，不同铁浓度对部分空肠弯曲菌的生物膜刺激作用不同。

  铁作为一种必需营养素参与空肠弯曲菌的多种生物过程，本研究结果表明，Fe2+和Fe3+均可促进空肠弯曲菌生物膜的形成。乳铁蛋白对铁的隔离降低了细胞内铁的水平，抑制了生物膜的形成。有报道称，氧化应激影响空肠弯曲菌生物膜的形成。ahpC的突变导致总ROS和脂质过氧化氢的积累，增强空肠弯曲菌的生物膜形成，抗氧化处理抑制ahpC突变的生物膜促进，PerR和CosR是空肠弯曲菌的关键氧化应激防御调节因子，也持续影响空肠弯曲菌的生物膜形成。根据本研究结果，铁通过氧化应激刺激空肠弯曲菌的生物膜可能涉及EPS的产生。EPS占生物膜干质量的90%以上，有助于营养物质的获取和干燥耐受。

  参考文献：Oh E, Andrews KJ, Jeon B. Enhanced Biofilm Formation by Ferrous and Ferric Iron Through Oxidative Stress in Campylobacter jejuni. Front Microbiol. 2018 Jun 6;9:1204. doi: 10.3389/fmicb.2018.01204. PMID: 29928267; PMCID: PMC5998592