合成新材料用于铜绿假单胞菌的检测

  铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)是医院感染中最难治疗的多重耐药菌之一。铜绿假单胞菌的常规检测方法耗时长或检测灵敏度低。本研究构建了一种新型的无酶电化学生物传感器，可快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌。首先，合成了比表面积大、吸附性能好的ZrMOF。并进一步与一定量的Cu2+连接，合成了具有高催化活性的Cu-ZrMOF。在此基础上，构建了CuZrMOF@Aptamer@DNA纳米复合物，并将其作为信号探针催化H2O2的降解。

  摘要：

  近年来，生物传感器在铜绿假单胞菌的检测中受到了越来越多的关注。例如，提出了一种局部表面等离子体共振适体来检测铜绿假单胞菌。Yue等人报道了一种用于检测铜绿假单胞菌的无标记电化学发光生物传感器，其使用具有严格宿主特异性的噬菌体作为特异性识别元件，然而操作过程相对复杂。还报道了基于果胶-金纳米复合材料检测铜绿假单胞菌的电化学免疫测定法，但灵敏度不令人满意。这些生物传感器方法可以在一定程度上克服常规方法的一些缺陷。然而，低信号放大效率作为一个关键问题，仍然不能满足临床需求，这限制了它们的临床应用。因此，有必要在临床上提供一种更灵敏、更有效的生物传感器来检测铜绿假单胞菌。基于Super P进行检测的研究很少报道。众所周知,金纳米粒子(AuNPs)具有良好的生物相容性和电导率。此外,他们可以为后续蛋白质提供足够的结合位点。因此,在本研究中,将Super P和AuNPs都连接到电极的表面以增加的电流信号，来获得令人满意的检测灵敏度。

  铜绿假单胞菌电化学检测示意图。

  图1.材料表征：(A)Super P的FE-SEM图像。(B)ZrMOF的HR-SEM图像。(C)ZrMOF的HR-TEM图像。(D)Cu-ZrMOF的EDS图。(E)适配体和DNA修饰前后Cu-ZrMOF的Zeta电位。

  制备由5g氯化钠、5g胰蛋白胨、2.5g酵母提取物、7.5g琼脂糖G-10和500mL ddH2O组成的500 ml Luria-Bertani(LB)培养基溶液。将所有细菌菌株与LB平板一起在含有5% CO2的培养箱中于37℃下新鲜培养16-24小时。应用麦克法兰比浊法定量铜绿假单胞菌。用PBS(0.01 mol L-1，pH 7.4)制备不同浓度(10、102、103、104、105和106 CFU mL-1)的细菌悬液。

  为了评估Super P对电导率的影响，通过CV测量测试了电流信号值。在图3A中，在对Super P进行改性后，电流信号显着增加，约为裸金电极的三倍。增加电导率的效果明显高于最近的报道。这表明Super P可以增加电流信号并有助于获得满意的检测灵敏度。如图3B所示，当将Cu-ZrMOF和Cu-ZrMOF @ Aptamer@DNA投射到金电极的表面上时，观察到不同且一致的DPV电流信号。表明两者均具有出色的催化活性。经适体和DNA修饰后，Cu-ZrMOF的催化活性没有降低。如图3C所示，当Super P(曲线a)、AuNPs(曲线b)、抗体(曲线c)、BSA(曲线d)和铜绿假单胞菌 (曲线e)固定在电极表面上时，没有观察到明显的DPV电流信号。如预期的那样，当信号探针(Cu-ZrMOF@Aptamer@DNA)连接在电极表(曲线f)上时，检测到明显的DPV电流信号。这表明电极的每个修饰步骤都不会干扰铜绿假单胞菌的检测。接下来，为了研究适体与铜绿假单胞菌的特异性结合能力，选择金黄色葡萄球菌作为对照。在图S2A中，铜绿假单胞菌可以与适体特异性结合;而金黄色葡萄球菌不能与它结合(图S2B)。在图S2C中，金黄色葡萄球菌上清液的荧光强度大约是铜绿假单胞菌的六倍。这意味着适体可以与铜绿假单胞菌特异性结合。

  ZrMOF、Cu-ZrMOF和Cu-ZrMOF@ Aptamer @DNA的合成

  在电化学生物传感器制造过程中的CV和EIS曲线:(A)工作电极的制造过程。(B)逐步的CV曲线。(C)EIS逐步曲线:(a)裸金电极，(b)Super P/金电极，(c)AuNPs/Super P/金电极，(d)抗体/AuNPs/Super P/金电极，(e)BSA/抗体/AuNPs/Super P/金电极，(f)铜绿假单胞菌/BSA/抗体/AuNPs/Super P/金电极。

  图3.电化学生物传感器的可行性研究：(A)具有和不具有Super P的金电极的CV电流信号。(B)Cu-ZrMOF和Cu-ZrMOF@Aptamer@DNA的DPV电流信号。(C)电极修改每一步的DPV电流信号：(a)Super P/金电极，(b)AuNPs/Super P/金电极，(c)抗体/AuNPs/Super P/金电极，(d)BSA/抗体/AuNPs/Super P/金电极，(e)铜绿假单胞菌/BSA/抗体/AuNPs/Super P/金电极，(f)信号探针(Cu-ZrMOF@Aptamer@DNA)/铜绿假单胞菌/BSA/抗体/AuNPs/Super P/金电极。(For对本图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本。)

  图4.电化学生物传感器的分析性能：(A)不同浓度铜绿假单胞菌的DPV电流信号。(B)不同浓度铜绿假单胞菌之间电流信号的线性。(C)所提出的电化学生物传感器针对不同细菌菌株的电流信号：(a)空白对照，(b)E.coli，(c)A.(d)S.aureus，(e)K.肺炎杆菌，(f)铜绿假单胞菌。误差线=SD(n=5)。

  为了验证所提出的电化学生物传感器在临床环境中的可行性，将其用于定量尿液中的铜绿假单胞菌。向尿样中加标浓度为10、103和105CFU mL-1的铜绿假单胞菌。然后用所提出的生物传感器对这些尿液样品进行定量。计算的回收率为96.9%-102.3%，RSD范围为3.8%-4.1%(n=5)，如表1所示。这表明该传感器对复杂基质样品具有良好的准确性，在临床检测铜绿假单胞菌方面具有很大的应用潜力。

  结语

  本研究构建了一种新型的无酶电化学生物传感器，可快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌。该生物传感器是利用Cu-ZrMOF的高催化活性和Super P和AuNPs的高导电性的信号放大策略。综合这些材料的优点，新型生物传感器具有较宽的检测范围和2CFU mL-1的低LOD(S/N=3)。此外，该生物传感器平台可以在120分钟内完成对铜绿假单胞菌的定量。值得注意的是，该生物传感器平台还可以用于检测其他生物靶标，包括细胞、肿瘤标记物和其他菌株，当然，这些靶标的特异性识别元素也需要相应的改变。当然，目前的方法仍有其局限性。例如，储存的稳定性生物传感器需要提示。而且目前的方法还没有组装成可直接用于临床的便携式护理点检测装置。进一步的研究旨在通过优化额外的参数来促进存储的稳定性，并简化组装成便携式设备的生物传感器。

  文章信息：A novel enzyme-free electrochemical biosensor for rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on high catalytic Cu-ZrMOF and conductive Super P

  DOI：10.1016/j.bios.2019.111486