金黄色葡萄球菌烈性噬菌体转录组分析

  转录组学分析可以通过研究噬菌体-细菌系统内的基因表达来研究噬菌体与细菌相互作用，为噬菌体治疗提供安全有效的数据支撑。Herelleviridae科(原属于Myoviridae科)的强烈性噬菌体以其裂解金黄色葡萄球菌的能力而闻名，已被证明是噬菌体治疗中最有效的噬菌体之一。

  转录组学研究的是特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA(包括mRNA和非编码RNA)的类型与拷贝数，它通过评估启动子和终止子的活性，识别转录单位的边界得到不同感染阶段的基因表达量。目前已研究的金黄色葡萄球菌Herelleviridae科烈性噬菌体的转录组分析，主要包括噬菌体vB_SauM-515A1、噬菌体K和噬菌体SAM1。噬菌体K是Herelleviridae科中研究最广泛的噬菌体之一，噬菌体SAM1和vB_SauM-515A1是从葡萄球菌噬菌体治疗剂中分离出来的。基因组分析，发现这3株噬菌体表现出高度的遗传相似性(图1)。

  图1：Herelleviridae科典型噬菌体(vB_SauM-515A1、SAM1和K)。(a)三种噬菌体基因的比较。不同颜色表示不同的功能模块。(b)显示了三种Herelleviridae噬菌体的平均核苷酸同一性(下三角形)和平均氨基酸同一性(上三角形)。

  在进行转录研究时，使用MOI大于10可确保样品内的所有细菌细胞同时被噬菌体感染，从而能够分析噬菌体基因的表达以及受感染细菌的转录反应。为了进行差异基因表达分析，从未感染的细菌培养物中获得的RNA测序数据被用作对照。为了更全面地了解整个感染过程中的基因表达，建议在整个感染过程中多个时间点进行RNA测序。可以根据噬菌体在宿主菌株上的单周期生长曲线，选择合适的RNA测序时间点，以确保在整个感染过程中全面覆盖基因表达。Herelleviridae科的噬菌体平均潜伏期通常为30至50分钟。因此，根据所涉及的特定噬菌体和宿主菌株、不同时间点选择转录组学分析样本。

  Kornienko M和Finstrlová A等的感染早期阶段转录组数据分析显示，绝大多数测序reads反应的是细菌基因组 (>95%);然而，随着感染的进行，噬菌体成分迅速增加，最终达到56-72%;不过在Arroyo-Moreno等的研究中，定位到噬菌体的reads数量几乎保持不变，约为50%，这可能与选择的时间点有关，对于感染的初始阶段相比，此时细胞中噬菌体mRNA的数量可能已经显著增加。

  如前所述，RNA测序可以确定噬菌体的转录范围，即通过鉴定启动子和终止子区域，以及评估不同感染阶段的基因表达。对Herelleviridae科噬菌体的早期和中期启动子的分析表明，它们属于σ70家族启动子，属于典型的启动子。该类型噬菌体启动子具有一致结构，由- 10区 (TATANT) 和前面的扩展元件 (TRTGN) 以及-35区 (TTGACW) 组成。晚期噬菌体基因的启动子包含一个保守的- 10区 (TGTTATATTA)，这与早期和中期的不同，并且也没有- 35区[29,30]。转录终止子具有典型的ρ独立终止子结构。通过利用启动子和终止子位置数据，vB_SauM-515A1和K噬菌体预测了噬菌体中转录单位的类型和位置 (图2)，而由于缺乏终止子的数据，尚未对噬菌体SAM1进行同样的分析。

  图2：vB_SauM-515A1的基因组结构和转录图谱

  RNA测序分析表明，在噬菌体中80%以上的基因受σ70启动子(即早期启动子和中期启动子)调控，并在感染早期启动转录。此外，tRNA在感染中期被转录。在感染过程的后期阶段，包括结构基因以及负责产生参与噬菌体颗粒包装的产物的基因被转录;Finstrlová A等人的研究发现，在感染过程中最后表达的基因是holin和endolysin。在噬菌体K和vB_SauM-515A1中，有两种相似的长链非编码RNA大量表达，这些RNA在相对于tRNA基因的位置和转录水平方面表现出相似性;然而，确定这些非编码RNA的功能仍然具有挑战性。

  不同的金黄色葡萄球菌菌株对Herelleviridae科烈性噬菌体的转录反应会出现一定挑战。在研究中发现使用不同的生长培养基也会导致转录谱差异;此外，重要的是生物信息学处理对观察到的转录数据变化也有实质性的影响。

  无论细菌还是噬菌体，噬菌体感染都会诱导与核苷酸生物合成、氨基酸代谢、应激反应和氮代谢相关的基因表达改变。除了基本代谢过程的变化外，在所研究的金黄色葡萄球菌菌株中还显示出许多毒力因子基因表达水平的增加。在金黄色葡萄球菌对感染反应的研究中观察到的另一个值得注意的共同特征是前噬菌体基因的上调。转录组学数据显示，仅在特定的金黄色葡萄球菌前噬菌体中观察到表达水平的变化;这种变化可能归因于所涉及的特定类型的前噬菌体。当根据整合酶分型对前噬菌体进行分类时，在携带Sa3、Sa5和Sa7整合酶型的前噬菌体中观察到高表达，目前现有的资料还不足以得出金黄色葡萄球菌中烈性噬菌体诱导何种前噬菌体的结论。

  参考论文

  1. Kornienko M, Bespiatykh D, Gorodnichev R, Abdraimova N, Shitikov E. Transcriptional Landscapes of Herelleviridae Bacteriophages and Staphylococcus aureus during Phage Infection: An Overview. Viruses. 2023; 15(7):1427. https://doi.org/10.3390/v15071427

  2. Finstrlová A, Mašlaňová I, Blasdel Reuter BG, Doškař J, Götz F, Pantůček R. Global Transcriptomic Analysis of Bacteriophage-Host Interactions between a Kayvirus Therapeutic Phage and Staphylococcus aureus. Microbiol Spectr. 2022;10(3):e0012322. doi:10.1128/spectrum.00123-22

  3. Kornienko M, Fisunov G, Bespiatykh D, et al. Transcriptional Landscape of Staphylococcus aureus Kayvirus Bacteriophage vB_SauM-515A1. Viruses. 2020;12(11):1320. Published 2020 Nov 17. doi:10.3390/v12111320

  4. Arroyo-Moreno S, Buttimer C, Bottacini F, et al. Insights into Gene Transcriptional Regulation of Kayvirus Bacteriophages Obtained from Therapeutic Mixtures. Viruses. 2022;14(3):626. Published 2022 Mar 17. doi:10.3390/v14030626