特异性捕获铜绿假单胞菌以快速检测尿路感染中的抗菌素耐药性

  UTIs是最常见的微生物疾病之一，严重危害人类公众健康，且消耗了大量的公共资金。临床上UTIs的治疗往往采取经验性广谱抗生素用药方案，这在很大程度上加速了抗生素耐药性(AMR)。P.ae是院内感染的主要病原菌之一，与住院患者的高死亡率相关，且其感染往往面临复杂的治疗方案。因而，在开具抗生素处方之前获得尿样中P.ae的耐药性谱是非常必要的。不过，目前AMR的诊断技术检测周期长。尤其是面对目标病原数量少的样本，预培养/富集步骤必不可少。抗体在富集细菌方面应用较多，但是其制作成本昂贵，而且其体积较大很难固定在相应介质的表面(特别是球面)，这在很大程度上限制了它们在基于球体颗粒的致病菌检测应用。除抗体外，一些蛋白质(亲和素、生物素等)、适配体以及碳水化合物也可以用于病原的靶向筛查，不过特异性差是这些介质存在的普遍问题。基于此研究背景，Pan等人设计开发了一个靶向尿液样本中P.ae耐药性的诊断系统，通过在磁性纳米颗粒(MNPs)修饰上一种特定的肽应用于样本中P.ae的特异性捕获，然后通过基于化学发光的方法判断细菌耐药性(图1)。

  图1 抗生素耐药性的快速检测方案。(a)利用肽修饰聚乙二醇化磁性纳米团簇(PEG@MNCs));(b)将肽修饰的聚乙二醇化磁性纳米团簇(peptide@PEG@MNCs)加入细菌悬液中，随后在磁场下收集细菌;(c)基于发光法评估抗生素存在下收集的细菌的生长情况，以区分敏感和耐药菌。

  在研究内容上，作者首先明确了peptide@PEG@MNCs特异性捕获菌悬液中P.ae的工作条件，包括肽的最佳修饰浓度、菌悬液浓度以及冲洗磁珠提高捕获特异性(图2-3)。在这里，作者也表征了peptide@PEG@MNCs对细菌的捕获灵敏度为10-105 CFU/mL(图3e)。不过，尽管通过PBS冲洗peptide@PEG@MNCs(共处理后)能够有效提高P.ae的特异性捕获效率，但是对菌的捕获率却有相应程度的减少。随后，作者利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌作为干扰菌与P.ae混合以模拟尿路感染样本，从而进一步评价所构建的peptide@PEG@MNCs在复杂样本中的细菌捕获能力。结果显示，模拟样本中敏感和耐药P.ae的捕获效率分别为85.9%和78.1%，也证明了基于AquaSpark发光探针和光学密度在30 min内对捕获的P.ae进行耐药性分析的可行性。在尿液中P.ae和三种杂菌中的任意一种共存的情况下，P.ae的捕获率与单独存在时基本一致：敏感/耐药P.ae捕获率分别为55%和40%左右，由此证明peptide@PEG@MNCs对P.ae的特异性捕获作用，此结果可靠性也通过PCR得到了验证。最后，作者将分离的P.ae与庆大霉素(+/-)一起孵育，并比较敏感/耐药株在抗生素存在/不存在情况下的生长情况。结果显示，在60 min后，P.ae敏感株和耐药株的发光强度存在差异，尽管在这段时间内两种菌株的光密度并无明显差异，由此证明了此方法的高灵敏度(图4)。

  总的来说，作者构建了一种肽修饰的磁性纳米颗粒，此颗粒可以特异性地捕获尿液样本中的P.ae，并用于后续的快速药敏分析(30min)。另外，此功能化的磁性纳米团簇具有很强的靶向P.ae的诊断潜力，可扩展至其它P.ae相关感染疾病。不过，由于其特异性捕获要求，也在很大程度上损害了细菌的捕获效率，这可在未来的进一步研究中予以优化和提高。

  图2 无冲洗条件下peptide@PEG@MNCs捕获细菌的能力展示。(a)不同浓度肽溶液中peptide@PEG@MNCs的功能化效率。P1-P5表示肽溶液浓度分别为0.02、0.2、1、2和20 mM。(b)2 mM肽修饰peptide@PEG@MNCs的扫描透射电子显微镜成像图。(c)2 mM肽修饰peptide@PEG@MNCs对不同浓度的敏感P.ae的捕获能力分析。(d)对P.ae、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的细菌捕获效率表征。

  图3 P.ae的特异性捕获的实现。(a)5次冲洗处理过菌悬液的peptide@PEG@MNCs后实现敏感P.ae的特异性捕获。(b)peptide@PEG@MNCs、MNCs、PEG@MNCs、peptide@MNCs对P.ae、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的捕获情况比较。实验条件：细菌与相应纳米磁珠团簇共处理10 min，磁场收集捕获的细菌后用PBS洗涤5次。随后将获得的纳米团簇分散至琼脂平板上，于37 ℃下过夜培养。所获得的菌落代表了在纳米团簇上收集到的细菌。(c)不同纳米团簇与不同细菌的亲和力评价。(d)优化P.ae和peptide@PEG@MNCs共处理的时间以提高捕获率。敏感P.ae和耐药P.ae的初始菌悬液浓度分别为542000 ± 8000和436000 ± 38000CFU/mL。(e)评估peptide@PEG@MNCs对敏感P.ae和耐药P.ae的捕获灵敏度，考察菌液浓度105- 100 CFU/mL。敏感和耐药P.ae的初始菌悬液浓度分别为327000 ± 23000和439000 ± 39000 CFU/mL，3个技术重复。

  图4 人工模拟尿液样本中的细菌捕获。(a)对于敏感和耐药P.ae菌悬液初始浓度分别为715000 ± 42000和175000 ± 11000 CFU/m的捕获率。(b)通过AquaSpark发光试验检测使用10 μg/mL庆大霉素处理捕获的P.ae的生长情况。(c)peptide@PEG@MNCs从添加敏感/耐药P.ae、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或混合液的人工尿液中特异性捕获P.ae。(d)应对初始菌液浓度分别为760000±7900001097000±350000、2320000 ± 157000、1453000 ± 488000、185000 ± 23000 CFU/mL的敏感/耐药P.ae、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，peptide@PEG@MNCs的捕获效率表征。可以观察到，有杂菌存在情况下peptide@PEG@MNCs对P.ae的特异性捕获率与仅P.ae存在下的捕获率基本一致。(e)通过AquaSpark发光试验检测使用和不使用10 μg/mL庆大霉素处理捕获的P.ae的生长情况。

  原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114962