基于抗生素-酶-无机纳米花免疫测定法超灵敏检测金黄色葡萄球菌

  目前，食源性致病菌仍是全球公共卫生的主要威胁。传统的微生物培养方法检测细菌繁琐且耗时，需要富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定和必要的动物试验等。PCR也是广泛使用的检测方法之一，其中细菌必须先富集，然后裂解以释放DNA。纯化扩增后，通过电泳或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。因此，其应用也存在一定的局限性，例如其专业技术要求高、操作步骤复杂等。

  纳米结构材料因其独特和可调的特性作为酶固定化载体被越来越多地使用。在这些纳米结构材料中，一类新开发的蛋白质-无机杂化纳米结构，即有机-无机花状杂化纳米花，因其合成简单、效率高、酶稳定能力等优点，近年来引起了广泛关注。酶金属盐纳米花的生产正在成为一种越来越流行的固定酶的策略。利用酶作为有机成分，酶-无机杂化纳米花表现出独特的分层纳米结构，增强的稳定性，耐久性和催化活性。这种产生基于蛋白质无机的纳米花的仿生策略提供了其他杂交系统的蓝图。

  方法：通过将万古霉素(VAN)和HRP在室温下组装到钙离子溶液中一定时间来制造基于酶的花状纳米复合材料。合成的抗生素-酶-无机杂化纳米花(VAN-HRP-CaHPO4 NFs)被用作双重功能捕获和信号探针，以提高酶的信号传递能力，并满足检测金黄色葡萄球菌抗体的要求。在这项工作中，选择金黄色葡萄球菌作为靶细菌来确认新的基于策略的ELISA，其中金黄色葡萄球菌可以与VAN-HRP-CaHPO4 NFs结合，然后被预先包装在96孔微量滴定板中的猪IgG识别和捕获。

  图1.(A)VAN-HRP-CaHPO4 NFs的制备工艺(B)基于VAN-HRP-CaHPO4 NFs夹心结构的ELISA用于检测金黄色葡萄球菌。

  结果：采用基于纳米花的ELISA系统对金黄色葡萄球菌进行定量测定。在图4E中，ELISA的定量结果显示，随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，OD值有所改善。图4F显示了OD值与金黄色葡萄球菌浓度之间的校准曲线。结果表明，OD值的提高对金黄色葡萄球菌浓度高度敏感，也证明了基于VAN-HRP-CaHPO4 NF的ELISA可定量检测1.0 × 10²的金黄色葡萄球菌至 1.0 × 10⁷ CFU mL^-1。检测限(LOD)定义为3Sb/m，其中Sb是空白的标准偏差(n = 3)，m是校准图的斜率。在这项工作中，LOD计算为4.3 CFU mL^-1。

  图4. (E)基于VAN-HRP-CaHPO4 NFs的ELISA检测金黄色葡萄球菌测定性能。(F)基于VAN-HRP-CaHPO4 NFs的ELISA检测金黄色葡萄球菌的校准曲线。

  结论：展示了一种创新且简单的自组装方法，用于VAN-HRP-CaHPO4 NFs的绿色合成。不需要化学修饰和耦合反应来制造这种信号探头。VAN-HRP-CaHPO4 NFs具有增强的稳定性和催化活性，可作为比色平台中的信号探针，以取代常见的HRP偶联抗体。基于VAN-HRP-CaHPO4 NFs的ELISA具有检测金黄色葡萄球菌的超灵敏性能，检测范围广(1.0 × 10²至 1.0 × 10⁷ CFU mL^-1)和4.3 CFU mL^-1的检测下限。该ELISA的这种性能与最常用的PCR方法相当，但其操作要简单得多。因此，开发了基于VAN-HRP-CaHPO4 NFs的夹心ELISA可作为食品安全或环境监测中金黄色葡萄球菌污染的有力筛查工具。纳米复合材料的制备工艺简单，ELISA对金黄色葡萄球菌的超灵敏检测性能都表明，酶-无机杂化纳米花在免疫传感器中的应用潜力巨大且前景广阔。

参考来源：Zhao M, Yao X, Li J, et al. Antibiotic-enzyme-inorganic nanoflowers based immunoassay for the ultrasensitive detection of Staphylococcus aureus[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2023, 230: 115264.