核心提示：蛋白质作为生命活动的主要承担者，是最常见的药物靶点。在药物的早期开发过程中，对所设计的药物与对应靶标蛋白相互结合的表征是药物发展的一个极其重要的指标。

  蛋白质作为生命活动的主要承担者，是最常见的药物靶点。在药物的早期开发过程中，对所设计的药物与对应靶标蛋白相互结合的表征是药物发展的一个极其重要的指标。而细胞本身作为一个复杂而精密的体系，其中存在着丰富多样的蛋白质等生物大分子以及它们之间复杂多变的相互作用。在生理条件下研究药物小分子与靶标蛋白的相互作用一直是领域内的一大挑战，目前多数的方法局限于通量较低，且很难给出生理条件下结合的直接证据。领域中的金标准是通过共结晶的方法使用X射线对目标蛋白与小分子结合的晶体结构进行表征，但此方法对样品的纯度等条件都有很苛刻的要求，通量很低且不具有很好的普适性。传统的表面等离子共振等方法虽然可以提供直接相互作用证据，但也同样需要大量纯化的蛋白质样品，且体外条件通常不能很好地模拟细胞内的环境。

  2013年，瑞典Karolinska研究所的团队在Science杂志上发表了可以在细胞里直接测量药物小分子与靶标蛋白质分子结合程度的技术，命名为细胞热迁移技术(Cellular Thermal Shift Assay, CETSA)。这一技术的原理在于：随着温度的升高，蛋白质会发生变性过程，结构改变甚至发生聚沉过程，通过免疫印迹western blot等方法可以对细胞内蛋白质含量进行检测；而在蛋白质与相应的配体药物小分子结合后，其热稳定性会得到一定程度的增强，使用同样的热处理与测量方法可以观察到明显的热迁移现象，而热迁移的程度就可以直接表征蛋白质与小分子的结合程度。

  传统的CETSA技术表现为依赖细胞裂解的非标记终点检测技术，需要每种温度进行单独的样品制备与免疫印迹示踪与质谱分析，这类方法需要使用高质量的抗体和流程优化。而虽然有使用纳米荧光素酶等方法对蛋白质样品进行标记来表征其热迁移程度的工作，但这类技术一方面依然只能作为终点检测，且其所使用的NanoLuc等染料本身的热稳定性也会对样品造成干扰。基于上述方法与相应的问题，作者团队在本篇工作中开发了一种可以在细胞样品中实时监测蛋白质热迁移现象的CETSA技术，命名为real-time CETSA(RT-CETSA)。

  图1. 实时活细胞热迁移技术(RT-CESTA)的开发。A) 实验技术流程图；B) 融合表达热稳定荧光素酶标签的目标蛋白以及其进行热迁移测量的表征示意。

  想要对同一个样品进行一定温度变化范围内的蛋白热稳定性测量，首先需要解决的是NanoLuc本身聚沉温度的问题。在Promega公司所开发的Split NanoLuc体系中，作为大亚基的变体LgBiT被工程化改造后可以表现出更强的分子间相互作用。基于这一点，作者首先进一步优化了这一体系，通过对LgBiT与HiBiT两部分以其结合体进行热稳定性检测，作者发现两者通过甘氨酸-丝氨酸的linker进行连接后热稳定性得到了极大的增强，半沉聚温度从NanoLuc本身的63度增加到90度以上，这使得样品可以进行的热处理温度范围更大。最终他们优化了linker长度，使用6个GS重复的linker连接两个亚基，构成用于后续热迁移实验的ThermoLuc。通过将ThermoLuc、NanoLuc分别与乳酸脱氢酶LDHA融合表达在一起并进行加减抑制剂的热迁移检测，结果表明，由于NanoLuc本身较差的热稳定性，抑制剂对LDHA的热稳定性增强效果无法被有效地表征出来，而ThermoLuc的实验组可以观察到很明显的热迁移现象。

  图2. 改造后的ThermoLuc凭借本身极强的热稳定性，可以有效地表征大范围温度变化中小分子与目标蛋白结合后的热迁移现象。

  实时监测其次需要的是可以进行温度调控以及实时检测发光信号的仪器。尽管市面上并没有直接符合要求的仪器，作者想到利用qPCR仪本身可以设制并调控温度变化的功能，进一步将其中的光学设备由荧光成像仪替换为可以检测ThermoLuc发光信号的Orca R2 CCD，这就使得样品可以在仪器中进行加热的同时实时检测每一个温度下的化学发光信号强度，从而直接绘制出蛋白质聚沉程度随温度变化的曲线。

  图3. 对进行RT-CETSA检测仪器的改造。

  在搭建好了RT-CETSA检测的构建与设备后，作者团队围绕LHDA蛋白对这一方法进行了一系列可行性的表征。首先他们证明了相对于传统的终点检测方法，实时的检测由于可变温度的调节，每个温度节点可以只对样品处理很短的时间。对标传统方法的数分钟延迟，实时检测技术在一分钟以内的处理时间就可以表征出很明显的蛋白热迁移现象。

  图4. 每组样品短时间的温度处理依然可以实时灵敏地得到热迁移检测结果。

  随后作者使用了德国结构系统生物学中心CSSB所开发的MoltenProt软件对LDHA-ThermoLuc模型进行了热处理与抑制剂结合情况下的去折叠曲线绘制与评估，证明了这一实时检测方法的可行性并进一步将其应用到了多种LDHA抑制剂以及一系列临床相关蛋白marker的展示之中。

  图5. 使用MoltenProt软件对LDHA-ThermoLuc模型进行热处理下实时蛋白去折叠曲线的绘制。

  总而言之，作者在本篇工作中发展了新一代的蛋白热迁移检测技术RT-CESTA，可直接用于活细胞样品中对目标蛋白与小分子结合的实时检测。这种高通量的精准检测技术有望成为药物开发过程中的有力检测平台。

  英文原题：Real-Time Cellular Thermal Shift Assay to Monitor Target Engagement

  ACS Chem. Biol. 2022, ASAP Publication Date:September 1, 2022

  https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00334