铜绿假单胞菌内部的小秘密

  近年来，铜绿假单胞菌PAO1由于具有高度组织化的群体感应机制和生物膜形成能力，对传统抗生素产生耐药性，成为医院感染的重要病原微生物。铜绿假单胞菌是临床上最常见的机会性人类病原体之一，可引起一系列危及生命的感染，如尿路感染(UTIs)、囊性纤维化(CF)、角膜创伤、烧伤和伤口的感染，并导致免疫功能低下患者的显著死亡率，铜绿假单胞菌在自然界中普遍存在，并能在不同的环境条件下生长，由于其高度复杂的调控网络和形成生物膜的能力，具有很高的表型可塑性。致病性和生物膜形成的趋势可归因于称为群体感应(QS)的细胞间信号交流机制的高度组织化的社会行为，铜绿假单胞菌的QS是由LasI-LasR、RhlI-RhlR和PQS-MvfR三个主要的层级信号系统组成的，这三个复合信号系统能产生多种毒力因子，如LasB弹性蛋白酶、LasA蛋白酶、绿脓杆菌素、海藻酸钠、鼠李糖脂、细胞毒性凝集素和eDNA等，毒力表型的产生依赖于细胞密度介导的同源转录调控因子及其信号自诱导子分子的激活，如3-oxo-C12-高丝氨酸内酯(C12-HSL)、正丁基-L-高丝氨酸内酯(C4-HSL)和2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(PQS)。

  近几十年来，由于滥用抗菌药物治疗铜绿假单胞菌引起的感染，出现了多重耐药菌(MDR)现象，引起了公众的严重关注。在这种背景下，开发新的有效的抗感染治疗药物，特别是针对高度组织的QS系统和相关的毒力因子，而不是通过杀菌特性来控制，在后抗生素时代似乎更加合适和具有深远的意义，在这方面，合成呋喃酮、自诱导子类似物和其他合成药物在下调铜绿假单胞菌的毒力表型的表达和有关生物膜的发展等方面具有广大的前景。然而，与合成群体感应抑制剂(QSI)有关的相对毒性和生物利用度问题，科学界现在将研究重点放在从未开发的自然资源(如植物和植物衍生的植物成分和微生物次生代谢物)开发出QSI上。在自然来源中，植物和植物来源的植物成分由于其巨大的治疗特性以及在治疗不同细菌感染方面的民间应用，仍然是针对铜绿假单胞菌QS毒力和生物膜形成的最有潜力的来源，除了植物来源外，细菌、真菌和多孔动物门也被用来研究它们在降低铜绿假单胞菌群体感应以调节毒力因子方面的功效。海洋真菌黑绿青霉对铜绿假单胞菌的群体感应减弱作用已有研究报告，然而，真菌次生代谢物的群体淬灭潜能尚未被发现，为开发新型抗感染药物提供了广泛的途径。

  在这一背景下，本研究着重研究了大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物对铜绿假单胞菌PAO1群体感应调节毒力因子和生物膜形成与发展的抑制作用。体外实验结果进一步验证了在分子对接研究中对群体感应减弱机制的理解，本研究将为开发新型高效抗感染药物提供更大的前景。

  实验结果：

  生长曲线分析

  从生长曲线分析，大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物处理的铜绿假单胞菌PAO1表现出与未处理对照组相似的特征性S型生长曲线，但生长速度相对较慢，如上图所示。

  亚MIC浓度水平的大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物对铜绿假单胞菌PAO1裂解葡萄球菌细胞的能力有显著影响，与对照组相比，在250、500和750μg/ml浓度下观察到的葡萄球菌溶解活性分别为42.4±5.01、54.26±6.31和68.72±5.82%，如上图所示。在本研究中，在亚MIC水平下250、500和750μg/ml浓度的大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物对铜绿假单胞菌的蛋白酶的活性有一个显著的减少，抑制率为分别为27.34 ± 3.21、40.06 ± 4.37和66.52 ± 5.41%。在亚MIC浓度的大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物处理下，LasB介导的铜绿假单胞菌PAO1弹性蛋白酶的活性得到显著的改变，与对照组相比，在250、500和750μg/ml浓度时，弹性蛋白酶活性分别下降41.26±2.58、60.64±4.96和71.26±4.58%。同样几丁质酶的活性也受到提取物的强烈抑制。

  对抗游动和群游运动

  铜绿假单胞菌PAO1在用大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物处理后，菌毛介导的群游运动明显减少，与对照组相比抑制率为82.4±2.38%，如上图所示。此外，用亚MIC浓度的大豆北茎溃疡病菌SSP12的提取物处理的铜绿假单胞菌PAO1的鞭毛介导游动能力也比对照组显著降低了90.65±3.74%，如上图所示。实验结果表明，与对照组相比，用大豆北茎溃疡病菌SSP12的提取物处理后，铜绿假单胞菌PAO1中EPS的产生显著减少，从而形成白色菌落。

  细菌生物膜的显微镜分析

  通过显微镜分析，观察到与对照组相比，用大豆北茎溃疡病菌SSP12的提取物处理的细菌细胞形成的生物膜密度和厚度显著降低，如上图所示，同样，荧光显微镜分析铜绿假单胞菌PAO1在大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物存在条件下形成的生物膜，发现与对照组相比，具有分散外观的生物膜形成对细胞的附着明显减少，如上图所示。CLSM分析显示，与未处理样品相比，在提取物存在下生长的铜绿假单胞菌PAO1形成的生物膜显著减少，通过显微镜下观察形成的生物膜，进一步证实了大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物抑制生物膜形成的作用。CLSM分析证实，经过提取物处理后，生物膜的形成显著减少，细菌细胞的分散性增加，而未处理的对照组，表面生物膜厚、突出且高度致密。

  分子对接实验

  对GC-MS分析得到的活性成分进行分子对接研究，揭示了这些活性成分与同源受体蛋白LasR和RhlR的结合亲和力，并与天然配体进行了比较。在通过GC-MS分析获得的生物活性成分中，非那克隆对LasR的亲和力最高，对接分数为-7.705 kcal/mol，观察到其比已知的抗群体感应化合物黄芩素大。同样，对于RhlR，最高的对接分数是DTBP的-5.893 kcal/mol，甚至比天然配体(C4-HSL)和标准抗群体感应化合物呋喃酮C30的对接分数更好。

  非那克隆和DTBP减弱铜绿假单胞菌的群体感应系统调控的毒性和生物膜形成的可能活性机制如上图所示。

  文章总结：在本研究中，作者利用分子对接的方法，研究了大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物对铜绿假单胞菌PAO1的群体感应减弱的作用，750μg/ml浓度的大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物对LasI/R介导的LasA蛋白酶、LasB弹性蛋白酶和几丁质酶的抑制率分别为66.52±5.41、71.26±4.58和61.16±4.28%，此外，在亚MIC浓度的大豆北茎溃疡病菌SSP12处理下，RhlI/R介导的绿脓素、胞外多糖和鼠李糖脂的产量也分别下调了74.71±3.97、66.41±3.62和63.75±3.76%。荧光和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析证实了生物膜形成的明显破坏，气相色谱-质谱(GC-MS)分析表明，大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物中含有苯乙醇、2，4-二叔丁基苯酚、非那克隆、1，4-邻苯二乙酸和苄肼等生物活性成分。在分子对接研究中，非那克隆和2，4-二叔丁基苯酚竞争性地与QS受体LasR和RhlR结合，改变其同源配体的结合，调节毒力表型的表达。大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物具有很好的抗群体感应作用，这为从真菌代谢产物中开发抗感染药物以解决传统抗生素治疗相关问题提供了新的途径。

  要点

  1.大豆北茎溃疡病菌SSP12提取物对LasI/R介导的LasA蛋白酶、LasB弹性蛋白酶和几丁质酶进行抑制。

  2.大豆北茎溃疡病菌SSP12处理下，RhlI/R介导的绿脓素、胞外多糖和鼠李糖脂的产量也分别下调。

  3.大豆北茎溃疡病菌SSP12的提取物能够分散生物膜并且减少生物膜的形成，非那克隆和2，4-二叔丁基苯酚竞争性地与QS受体LasR和RhlR结合，改变其同源配体的结合，调节毒力表型的表达。

  参考文献

  Pattnaik SS, Ranganathan S, Ampasala DR, Syed A, Ameen F, Busi S. Attenuation of quorum sensing regulated virulence and biofilm development in Pseudomonas aeruginosa PAO1 by Diaporthe phaseolorum SSP12. Microb Pathog. 2018 May;118:177-189. doi: 10.1016/j.micpath.2018.03.031. Epub 2018 Mar 20. PMID: 29571725.