核心提示：在构建纳米级的仿生催化反应器的研究中，酶的催化效率依赖于活性位点的暴露和空间构象的自由展开，而以上两点都需要酶所处的微环境具有一定的空间。因此，给仿生纳米反应器中的酶创建具有一定空间活动的微环境对于提升酶的催化效率具有重要的意义。
摘要：真核细胞的生物催化反应网络是通过多室化多酶体系实现的。受自然细胞空间定位的启发，多种酶被限制在多室微胶囊中，该微胶囊是使用气体剪切法结合表面触发原位凝胶化策略创建的。构建的微胶囊可以实现精准的实现内部多腔室定位能力，通过控制流速和剪切力等因素，可以构建2-8个腔室的微胶囊。对所生成的微胶囊以三步聚合酶级联反应建立研究模型，通过集成逻辑网络，实现了复杂的数字设计，并且所制备的微胶囊具有较高的稳定性、可回收性和细胞相容性，是用于仿生生物催化过程的理想的酶反应器系统。
采用气切法和表面凝胶法制备仿生微胶囊示意图
图a示意了通过气体剪切的方法制备纳米微粒的装置。具体方法是在铁芯喷雾喷射装置中，将内液流针同轴地插入外针中。气体会通过内针与外针之间的空间被输送，从而产生剪切力形成液滴。图b为气体流速分别为3、4、5和6L/min时制备的Fe3O4纳米颗粒的尺寸分布。图c为制备的纳米颗粒的光学图像。图d为制备的两面、三面、四面和六面的多腔室微粒的光学图像。图e为表面凝胶法制备微胶囊的示意图。首先涂上PDA-CaPs，并浸入海藻酸GDL溶液中。由于GDL会逐渐水解成葡萄糖酸，酸化引发Ca2+的释放，从而促进在内核表面形成海藻酸凝胶。图f是分别在10、20、30、40秒孵育的微胶囊的壳层厚度。图g为多腔室微胶囊的光学图像。图h分别为二、三、四、六面多腔室微胶囊的光学图像。
对比游离和封装在微胶囊中的黄嘌呤氧化酶的催化反应
图a为游离的黄嘌呤氧化酶反应示意图。图b和f是对比游离黄嘌呤氧化酶和微胶囊中黄嘌呤氧化酶对反应吸光度的影响。蓝色箭头表示黄嘌呤在OD值为272nm处的反应;红色箭头表示OD值在290nm时尿酸升高。图c和g是探究游离黄嘌呤氧化酶和微胶囊中黄嘌呤氧化酶在290 nm时反应吸光度的变化。图d和h是表示游离黄嘌呤氧化酶和微胶囊中黄嘌呤氧化酶在272 nm和290 nm处反应吸光度的变化。
构建微胶囊中多酶级联反应的示意图
图a为微胶囊中酶级联反应顺序的示意图。图b是黄嘌呤氧化酶第一次反应的吸光度变化。蓝色箭头表示黄嘌呤在OD值272nm处被氧化;红色箭头表示OD值290nm处尿酸升高。图c为尿酸水解酶第二次反应的吸光度变化。红色箭头表示尿酸在OD值290nm处的降低。图d是酶促反应两阶段在290 nm处吸光度的变化。图e是通过游离酶的一锅法级联反应示意图。图f是吸光度变化示意图。图g为分别包裹黄嘌呤氧化酶和尿酸酶的两个独立微胶囊的一锅级联反应示意图。图h为吸光度变化。图i是多室微胶囊中酶级联反应的示意图。图j是吸光度变化。图k为游离酶(左)、两个独立微胶囊(中)和多室微胶囊(右)在272 nm和290 nm处的吸光度变化。
微胶囊中的三酶级联反应示意图及性能研究
图a为微胶囊中的三酶级联反应示意图。图b为不同浓度黄嘌呤、POD(过氧化物酶)、尿酸酶和XOD(黄嘌呤氧化酶)对酶级联反应的影响。红色条表示相同实验条件下的结果。图c为不同化学输入信号的酶级联反应的逻辑网络表示。图d是三输入布尔与逻辑门，以黄嘌呤、微反应器和OPD为输入。e)相应逻辑门的相关具体数据。误差条表示标准差(重复=3)。
用不同浓度胰蛋白酶处理微胶囊(左)、核心颗粒(中)和游离酶(右)
图a是用不同浓度胰蛋白酶处理微胶囊(左)、核心颗粒(中)和游离酶(右)在450nm时DAP吸光度的变化。(n.s.表示无显著性，*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001)。图b是酶级联反应在450nm处的吸光度在微胶囊中进行了7个后续循环，而没有底物(黄嘌呤)组作为对照。误差条表示标准差(重复= 3)。
对微胶囊在实际样品中的性能探究
图a是用核颗粒或微胶囊处理的L929细胞的活/死染色(右)和细胞活力(左)。图b是芯粒和微胶囊的溶血率(上)和光学图像(下)。图c为用核心颗粒或微胶囊处理7天的斑马鱼体长变化(上)和活力(下)。
小结：
多室型核壳结构微胶囊的制备是模拟细胞内催化反应的关键所在，也是制备人工细胞器的重要手段，传统制备方法是通过气体进行剪切形成微胶囊，这种方法的弊端在于难以精确定位微胶囊内部隔间，导致多级酶联催化反应的效率较低。而本研究中通过方法改进，采用表面凝胶气体剪切法可以均匀、渐进地形成凝胶壳，并且可以精准定位微胶囊内部腔室的大小。
1.本实验开发了一种多腔室微胶囊的通用制备策略，通过气体剪切法结合表面凝胶化策略，成功制备出了2-8腔室的微胶囊。该创新结构解决了传统方法多腔室微胶囊结构难以精确控制的问题。并在此基础上，生成了具有并行计算潜力的三级联布尔与逻辑门系统。
2.本实验构建了在微胶囊中的三步聚合级联反应，通过添加底物邻苯二胺(OPD)作为显色底物，通过过氧化物酶活化H2O2氧化成橙色产物(2,3-二氨基苯肼，DAP)来监测其活性。用不同浓度的黄嘌呤、过氧化物酶、尿酸酶和黄嘌呤氧化酶来评价酶级联反应的效率。
3.通过三种逻辑门将反应器分成不同的酶作为单独的输入信号，可以得到更复杂的结果。研究发现微胶囊能够以可预测和精确的方式执行与代谢活动协调的基本分子算术函数，可以提供一个灵活的合成平台来研究复杂的代谢反应网络和包含的化学计算。
4.通过对活细胞/死细胞荧光图像和3-(4,5-二甲基噻唑-2-y l)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)测定显示了微胶囊良好的细胞相容性。
5.通过溶血试验，以及斑马鱼的长度变化和活力也证实了胶囊的低毒，这表明微球在生物医学领域有很大的潜力。
参考文献：
Qingli Qu, Xiaoli Zhang, Anquan Yang, Jing Wang，et al. Spatial confinement of multi-enzyme for cascade catalysis in cell-inspired all-aqueous multicompartmental microcapsules. Journal of Colloid and Interface Science 626 (2022) 768–774.
DOI：10.1016/j.jcis.2022.06.128
