摘要：幽门螺杆菌有许多毒力因子，它们以不同的方式导致胃病。因此，针对幽门螺杆菌的许多关键毒力因子设计多价表位疫苗是控制幽门螺杆菌感染的重要策略。与注射疫苗相比，口服疫苗提高安全性和依从性，以及更容易制造和管理等有利优势。然而，胃酸和蛋白水解酶等恶劣的胃肠道(GI)环境在一定程度上限制了口服疫苗的开发和利用。口服疫苗需要一种安全性高、价格低廉、促进刺激胃肠粘膜免疫反应的胃肠道给药系统。据已有报道，壳聚糖可以在蒙古沙鼠模型种降低幽门螺杆菌感染。并且乳酸菌是胃肠道益生菌，作为口服疫苗的递送系统具有独特的优势。在这项研究中，针对M细胞的乳球菌靶向表面展示系统命名为plSAM，该系统旨在帮助疫苗抗原在胃肠道中激发有效的免疫反应，基于表面展示系统，研究者构建了靶向M细胞的重组乳酸乳球菌疫苗LL-plSAM-FVpE。实验结果证实LL-plSAM-FVpE具有增强的M细胞靶向特性，可促进胃肠道M细胞对抗原SAM-FVpE的吞噬和转运。更重要的是，口服免疫LL-plSAM-FVpE可以刺激IgG、sIgA抗体和CD4 +T细胞针对幽门螺杆菌的四种毒力因子(脲酶、CagA、VacA和NAP)的免疫反应，从而在小鼠模型中提供针对幽门螺杆菌感染的保护性免疫。针对各种关键幽门螺杆菌毒力因子的M细胞靶向重组乳球菌疫苗可能是控制幽门螺杆菌感染的具有应用前景的候选疫苗。

  结果

  1. 重组乳球菌疫苗LL-plSAM-FVpE的表达分析

  经乳链菌肽诱导后，LL-plSAM-FVpE可产生融合蛋白SAM-FVpE (103.65 kDa)。此外，全细胞ELISA结果证实SAM-FVpE蛋白展示在细菌表面(图1)。

  图 1 重组乳球菌疫苗LL-plSAM-FVpE的表达和鉴定。

  2. LL-plSAM-FVpE特异性抗血清的特异性和疫苗抗原SAM-FVpE的免疫反应性

  Western blot (图2A)和ELISA (图2B)结果证实LL-plSAM-FVpE特异性抗血清可以识别四种幽门螺杆菌毒力因子(脲酶、NAP、VacA和CagA)。此外，SAM-FVpE蛋白可以与LL-plSAM-FVpE特异性抗血清发生特异性反应(图2E)。更重要的是，SAM-FVpE蛋白可以被幽门螺杆菌感染患者的血清识别(图2F)。

  图 2 LL-plSAM-FVpE的特异性和疫苗抗原SAM-FVpE的免疫反应性。

  3. M细胞靶向特性的检测

  进行回肠闭环测定和免疫组织化学(IHC)以确定LL-plSAM-FVpE和SAM-FVpE蛋白是否具有M细胞靶向特性。结果显示，与用FVpE蛋白处理的对照组相比，用LL-plSAM-FVpE或SAM-FVpE蛋白处理的组在淋巴集结中显示出更多的黄色荧光信号(图 3)，表明L. lactis LL-plSAM-FVpE或SAM-FVpE蛋白由于SAM成分而具有更好的M细胞靶向特性。

  图 3 M细胞靶向特性分析。白色箭头表示针对M细胞的抗原的共定位信号。

  4. 重组乳球菌疫苗LL-plSAM-FVpE的预防作用

  在口服疫苗接种和幽门螺杆菌攻击后，通过定量培养、qPCR和快速尿素酶测试分析胃中幽门螺杆菌的细菌载量。幽门螺杆菌定量培养胃镜检查，qPCR和快速尿素酶试验表明，使用LL-plSAM-FVpE或SAM-FVpE加PA的口服免疫显着降低了幽门螺杆菌数量和脲酶活性。通过HE染色、胃炎评分和免疫组织化学(IHC)进一步进行胃组织病理学验证显示，口服接种LL-plSAM-FVpE或SAM-FVpE加PA可显着减轻小鼠胃部炎症。此外，在LL-plSAM-FVpE组和SAM-FVpE加PA组之间未检测到胃部炎症程度的显着差异。

  图 4 保护作用和胃组织病理学分析。

  5. 预防性免疫后幽门螺杆菌特异性淋巴细胞和抗体反应

  ELISA板用0.5 μg/孔的幽门螺杆菌裂解物包被。通过ELISA检测血清、胃、肠和粪便样品中幽门螺杆菌特异性抗体。如图所示，口服接种L. lactis LL-plSAM-FVpE或SAM-FVpE蛋白加PA可刺激显着升高的血清IgG和粘膜sIgA抗体。此外，脾淋巴细胞培养物上清液中细胞因子的ELISA测定显示，用LL-plSAM-FVpE或SAM-FVpE加PA免疫的组具有显着升高的IFN-γ、IL-4和IL-17水平。

  图 5 预防性免疫后幽门螺杆菌特异性淋巴细胞和抗体反应。

  6. 重组乳球菌疫苗LL-plSAM-FVpE的治疗作用

  将重组乳酸乳球菌疫苗LL-plSAM-FVpE强饲给感染幽门螺杆菌的小鼠，以检查LL-plSAM-FVpE在消除幽门螺杆菌感染中的作用。

  图 6用重组乳球菌疫苗LL-plSAM-FVpE口服免疫的治疗效果。

  结论：幽门螺杆菌定植于人类的胃粘膜，与慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种胃病有关。幽门螺杆菌毒力因子，如脲酶、细胞毒素相关抗原A (CagA)、空泡细胞毒素A (VacA)和中性粒细胞激活蛋白 (NAP)，在幽门螺杆菌相关胃癌的发展中起重要作用。基于针对乳球菌设计的M细胞靶向表面展示系统，构建了针对幽门螺杆菌的4种关键毒力因子的乳球菌多价疫苗LL-plSAM-FVpE 。乳球菌LL-plSAM-FVpE可以在细菌表面展示SAM-FVpE抗原，并且具有增强的M细胞靶向特性。用口服LL-plSAM-FVpE免疫可以刺激针对幽门螺杆菌多种毒力因子(NAP、CagA、VacA和脲酶)的抗体，从而提供针对幽门螺杆菌感染的保护性免疫。重组乳球菌LL-plSAM-FVpE疫苗将在其他动物模型中进行评估，预计未来将进行针对幽门螺杆菌的乳球菌疫苗的临床试验。

  原文链接：Guo L, Zhang F, Wang S, Li R, Zhang L, Zhang Z, Yin R, Liu H, Liu K. Oral Immunization With a M Cell-Targeting Recombinant L. Lactis Vaccine LL-plSAM-FVpE Stimulate Protective Immunity Against H. Pylori in Mice. Front Immunol. 2022 Jul 7;13:918160. doi: 10.3389/fimmu.2022.918160. PMID: 35911756; PMCID: PMC9336465.